Невирусная генная терапия дает надежду при хронической боли в пояснице

В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Biomaterials, исследователи разработали новую не вирусную генную терапию для лечения дискогенной боли в спине (DBP) путем доставки транскрипционного фактора Forkhead Box F1 (FOXF1) с использованием инженерных внеклеточных везикул (eEV) в дегенеративные межпозвонковые диски (IVD) in vivo.

Хроническая боль в пояснице (LBP) является растущей глобальной проблемой из-за стареющего населения и усугубляющихся проблем с опиоидами. Текущие методы лечения включают краткосрочное облегчение или дорогостоящие операции, что подчеркивает необходимость в неаддиктивных и менее инвазивных терапиях.

Текущие биологические методы, включая введение факторов роста, клеточную терапию и вирусные генотерапии, могут снизить дегенерацию в животных и человеческих моделях. Однако такие проблемы, как кратковременные эффекты, плохая долгосрочная эффективность и ненужная иммуногенность и онкогенность, могут помешать прямому применению этих методов.

В данном исследовании исследователи установили не вирусную генную терапию для дегенерации межпозвонковых дисков (IVD) с использованием FOXF1-eEV.

Исследователи трансфицировали первичные мышиные эмбриональные фибробласты (PMEF) плазмидом, содержащим FOXF1 или pCMV6 в качестве контроля, и охарактеризовали образцы eEV с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA).

Они оценили эффективную загрузку молекулярного груза в eEV с использованием количественной обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) и обычной ПЦР. Вестерн-блот-анализ определил FOXF1 и специфические белки EV в eEV-формациях. Команда использовала плазмиды, усиливающие верхние и нижние полилинкерные области, чтобы определить наличие плазмидной ДНК FOXF1 в донорских клетках и сгенерированных eEV.

Они исследовали полноразмерную мРНК, произведенную из плазмидной ДНК в eEV и донорских клетках.

Исследователи создали внеклеточные везикулы с транскрипционными факторами для восстановления функции тканей и изменения болевых реакций в животной модели DBP.

Они определили EV для транспортировки и распределения FOXF1 в поврежденные межпозвонковые диски в модели мышей с дискогенной болью в спине, чтобы определить ингибирование FOXF1 eEV дегенерации межпозвонковых дисков.

Команда сочетала биомеханическое тестирование межпозвонковых дисков мышей с изображением, изменениями внеклеточного матрикса (ECM) и болевыми реакциями, оцененными через 12 недель, чтобы подтвердить изменения структуры и функции, а также боль, вызванную терапевтическим вмешательством.

Предоперационные и постлечебные болевые оценки включали микрокомпьютерную томографию (micro-CT), магнитно-резонансную томографию (MRI), механические тесты, окрашивание альциан-синим (AB) и пикросириус-красным (PSR), тест диметилметиленового синего и иммуногистохимию (IHC).

Исследование включало хирургическую технику, при которой исследователи подкожно вводили Buprenorphine ER мышам для контроля послеоперационной боли.

Команда проводила поведенческие оценки до операции и каждые две недели от четырех до двенадцати недель после операции, используя различные методы, такие как тест открытого поля, холодная пластина, подвешивание за хвост и подвешивание на проволоке.

Тест открытого поля оценивал спонтанную активность мышей; тесты на холодной пластине измеряли термическую гипералгезию; тесты подвешивания за хвост измеряли аксиальную боль; и тесты подвешивания на проволоке измеряли силу.

Через двенадцать недель после операции команда диссекцировала поясничный отдел позвоночника животных, используя трассировку бедренного нерва и артерии для идентификации межпозвонковых дисков между L4 и L5, L5 и L6, и L6 и S1 IVD. Они использовали L5/L6 IVD для оценки гистологии и определения содержания гликозаминогликанов (GAG).

FOXF1 eEV значительно уменьшили болевые реакции, восстанавливая структуру и функцию IVD, включая улучшение высоты диска, гидратации тканей, содержания протеогликанов и механических характеристик.

Исследование сосредоточилось на высвобождении eEV, загруженных FOXF1, из первичных фибробластов, трансфицированных транскрипционным фактором FOXF1. Количественная RT PCR показала значительное увеличение уровня транскриптов мРНК FOXF1 и уровней полноразмерной транскрибированной мРНК FOXF1 по сравнению с клетками, трансфицированными pCMV6.

Терапия FOXF1 eEV может уменьшить болевые реакции в модели прокола поясничного диска у мышей до 12 недель. Самки мышей показали большее время захвата в группе, получившей лечение FOXF1, чем в поврежденной группе, которое продолжалось по крайней мере 12 недель после лечения.

Терапия FOXF1 eEV улучшила гидратацию и высоту ткани IVD у поврежденных и дегенеративных животных in vivo, сохраняя уровни гидратации и интенсивность T2-взвешенного изображения IVD диска.

Однако команда наблюдала снижение высоты диска у раненых животных и животных, получивших лечение pCMV6 eEV. У мышей, получивших лечение FOXF1 eEV, не было снижения высоты диска через 12 недель после лечения. Пол не влиял на функциональные результаты.

FOXF1 eEV восстановили механическую функцию поврежденных и дегенеративных IVD in vivo. Под осевым напряжением IVD, обработанные FOXF1 eEV, показали более высокую нормализованную жесткость NZ по сравнению с поврежденными IVD.

В условиях ползучести поврежденные IVD демонстрировали увеличенные нормализованные смещения ползучести, что указывает на уменьшение нормализованной упругой жесткости ползучести.

Результаты показывают, что снижение содержания GAG в поврежденных IVD увеличивает механическую гибкость, но терапия eEV предотвращает потерю гликозаминогликанов и последующие изменения механических функций.

FOXF1 eEV вызвали структурные и функциональные изменения в IVD путем повышения уровней протеогликанов и GAG.

Результаты исследования показали, что eEV, загруженные транскрипционными факторами развития, могут лечить болезненные заболевания суставов, такие как DBP, доставляя эти транскрипционные факторы в дегенеративные и болезненные суставы IVD.

Эта стратегия может помочь уменьшить структурные и функциональные отклонения, вызванные заболеванием, а также регулировать болевые реакции в зависимости от пола.

Исследователи также рекомендовали использовать транскрипционные факторы развития, такие как FOXF1, для перевода дегенеративных NP клеток в проанаболическое состояние in vivo. Необходимы дальнейшие исследования для определения его терапевтической эффективности.