Нейральные стволовые клетки

Где находятся нейральные стволовые клетки?

Установлено, что нейральные стволовые клетки экспрессируют глиальный кислый фибриллярный белок, который среди зрелых клеток нейральной линии сохраняется только на астроцитах. Следовательно, стволовым резервом в зрелой ЦНС могут быть астроцитарные клетки. Действительно, в обонятельных луковицах и зубчатой извилине были выявлены нейроны, происходящие из GFAP-позитивных предшественников, что противоречит традиционным представлениям о прогениторной роли радиальной глии, не экспрессирующей GFAP в зубчатой извилине в зрелом возрасте. Не исключено, что в ЦНС существуют две популяции стволовых клеток.

Вопрос о локализации стволовых клеток в субвентрикулярной зоне также остается неясным. По данным одних авторов, эпендимные клетки образуют в культуре сферические клоны, которые не являются истинными нейросферами (как клоны клеток субэпендимы), поскольку способны дифференцироваться только в астроциты. С другой стороны, после флюоресцентной или вирусной маркировки клеток эпендимы маркер обнаруживается в клетках субэпендимного слоя и обонятельных луковиц. Такие меченые клетки in vitro формируют нейросферы и дифференцируются в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Кроме того, показано, что в эпендиме около 5% клеток экспрессируют стволовые маркеры - нестин, Notch-1 и Mussashi-1. Предполагается, что механизм асимметричного митоза связан с неравномерным распределением мембранного рецептора Notch-1, вследствие чего последний остается на мембране дочерней клетки, локализованной в эпендимной зоне, тогда как материнская клетка, мигрирующая в субэпендимный слой, лишается этого рецептора. С этой точки зрения, субэпендимную зону можно рассматривать как коллектор прогениторных предшественников нейронов и глии, образующихся из стволовых клеток эпендимного слоя. По мнению других авторов, в каудальных отделах субвентрикулярной зоны образуются только клетки глии, а источником нейроногенеза являются клетки рострально-латерального отдела. В третьем варианте передним и задним отделам субвентрикулярной зоны боковых желудочков придаются равнозначные нейрогенные потенции.

Предпочтительней выглядит четвертый вариант организации стволового резерва в ЦНС, согласно которому в субвентрикулярной зоне выделяются три основных типа нейральных клеток-предшественников - А, В и С. А-клетки экспрессируют ранние нейрональные маркеры (PSA-NCAM, TuJl) и окружены В-клетками, которые по экспрессии антигенов идентифицируются как астроциты. C-клетки, не имея антигенных характеристик нейронов или глии, обладают высокой пролиферативной активностью. Автором достаточно убедительно доказано, что В-клетки являются предшественниками А-клеток и образующихся de novo нейронов обонятельных луковиц. В процессе миграции А-клетки окружены тяжами нейральных клеток-предшественников, что существенно отличается от миграционного механизма постмитотических нейробластов вдоль радиальной глии в эмбриональном мозге. Миграция завершается в обонятельных луковицах митотическим делением как А-, так и В-клеток, производные которых встраиваются в слои зернистых клеток и в клубочковый слой ольфакторной зоны мозга.

В развивающемся мозге эмбрионов нет дифференцированных эпендимных клеток, а в состав стенок желудочков входят размножающиеся стволовые клетки вентрикулярной герменативной й субвентрикулярной зон, куда мигрируют первичные нейро- и глиобласты. Исходя из этого, некоторые авторы считают, что субэпендимная область зрелого мозга содержит редуцированную эмбриональную герменативную нервную ткань, состоящую из астроцитов, нейробластов и неидентифицированных клеток. Истинные нейральные стволовые клетки составляют менее 1% клеток герменативной зоны стенки боковых желудочков. Отчасти поэтому, а также в связи с данными о том, что астроциты субэпендимной зоны являются предшественниками нейральных стволовых клеток, не исключается возможность трансдифференцировки астроцитарных глиальных элементов с приобретением ими нейрональных фенотипических характеристик.

Основное препятствие для окончательного решения вопроса о локализации нейральных стволовых клеток in vivo - отсутствие специфических маркеров для этих клеток. Тем не менее, весьма интересными, с практической точки зрения, представляются сообщения о том, что нейральные стволовые клетки были выделены из отделов ЦНС, не содержащих субэпендимных зон - третьего и четвертого желудочков переднего мозга, спинномозгового канала грудного и поясничного отделов спинного мозга. Особенно важным является тот факт, что при повреждении спинного мозга усиливается пролиферация стволовых клеток эпендимы центрального канала с образованием прогениторных клеток, мигрирующих и дифференцирующихся в астроциты глиомезодермального рубца. Кроме того, клетки-предшественники астро- и олигодендроцитов обнаружены и в неповрежденном спинном мозге взрослых крыс.

Таким образом, данные литературы убедительно свидетельствуют о наличии в ЦНС взрослых млекопитающих, в том числе и человека, регионарного стволового резерва, регенерационно-пластическая емкость которого, к сожалению, способна обеспечить только процессы физиологической регенерации с образованием новых нейрональных сетей, но не соответствует потребностям репаративной регенерации. Это ставит задачу поиска возможностей увеличения стволовых ресурсов ЦНС экзогенным путем, что неразрешимо без четкого представления о механизмах формирования ЦНС в эмбриональном периоде.

Сегодня нам известно, что в процессе эмбрионального развития стволовые клетки нервной трубки являются источником клеток трех типов - нейронов, астроцитов и олигодендроцитов, то есть, нейроны и нейроглия происходят из единой клетки-предшественника. Дифференцировка эктодермы в кластеры нейральных прогениторных клеток начинается под влиянием продуктов пронейральных генов семейства bHLH и блокируется при экспрессии рецепторных трансмембранных белковых производных генов семейства Notch, которые лимитируют детерминацию и раннюю дифференцировку нейральных клеток-предшественников. В свою очередь, лигандами рецепторов Notch выступают трансмембранные белки Delta соседних клеток, за счет внеклеточного домена которых осуществляются прямые межклеточные контакты с индукционным взаимодействием между стволовыми клетками.

Дальнейшая реализация программы эмбрионального нейрогенеза не менее сложна и, казалось бы, должна быть видоспецифичной. Однако результаты нейроксенотрансплантационных исследований указывают на то, что стволовые клетки обладают выраженным эволюционным консерватизмом, благодаря чему нейральные стволовые клетки человека способны мигрировать и развиваться при их трансплантации в мозг крысы.

Известно, что ЦНС млекопитающих обладает крайне низкой способностью к репаративной регенерации, что характеризуется отсутствием в зрелом мозге каких-либо признаков возникновения новых клеточных элементов взамен погибших в результате травмы нейронов. Однако в случае трансплантации нейробластов последние не только приживляются, пролиферируют и дифференцируются, но и способны встраиваться в структуры мозга и функционально замещать утраченные нейроны. При трансплантации коммитированных нейрональных прогениторных клеток терапевтический эффект оказался значительно слабее. У таких клеток выявлена низкая способность к миграции. Кроме того, нейрональные клетки-предшественники не воспроизводят архитектонику нейронных сетей и функционально не интегрируются в мозг реципиента. В связи с этим активно изучаются вопросы репаративно-пластической регенерации при трансплантации непреформированных мультипотентных нейральных стволовых клеток.

В исследовании М. Александровой и соавторов (2001) в первом варианте экспериментов реципиентами выступали половозрелые самки крыс, а донорами были эмбрионы 15-суточного развития. Реципиентам удаляли участок затылочной коры мозга и в полость трансплантировали механически суспензированную ткань презумптивной эмбриональной коры, содержащую мультипотентные стволовые клетки вентрикулярной и субвентрикулярной области. Во втором варианте экспериментов осуществлялась трансплантация нейральных стволовых клеток 9-недельного эмбриона человека в мозг половозрелх крыс. Из перивентрикулярной области головного мозга эмбрионов авторы выделяли кусочки тканей, помещали их в питательную среду F-12 и путем многократного пипетирования получали суспензию клеток, а затем культивировали их в специальной среде NPBM с добавками ростовых факторов - FGF, EGF и NGF. Клетки выращивали в суспензионной культуре до формирования нейросфер, которые диспергировали и снова высаживали в культуру. Через 4 пассажа с общим сроком культивирования 12-16 суток клетки использовали для трансплантации. Реципиентами были десятисуточкые крысята и половозрелые двухмесячные крысы линии Вистар, которым в область латерального желудочка головного мозга вводили по 4 мкл суспензии нейральных стволовых клеток человека без проведения иммуносупрессии. Результаты работы показали, что диссоциированные клетки вентрикулярной и субвентрикулярной зоны эмбриональной закладки коры мозга крысы при аллотрансплантации в зрелый мозг продолжали свое развитие, то есть, факторы микроокружения дифференцированного мозга реципиента не блокировали рост и дифференцировку нейральных стволовых клеток эмбриона. В ранние сроки после пересадки мультипотентные клетки продолжали митотическое деление и активно мигрировали из области трансплантации в ткань мозга реципиента. Трансплантированные эмбриональные клетки, обладающие огромным потенциалом миграции, были обнаружены практически во всех слоях коры мозга реципиента вдоль трансплантационного трека и в белом веществе. Протяженность миграционного тракта нервных клеток всегда была значительно меньше (до 680 мкм), чем глиальных элементов (до 3 мм). Структурными векторами для миграции астроцитов служили кровеносные сосуды и волоконные структуры мозга, что отмечалось и в других исследованиях.

Ранее считалось, что накопление меченых астроцитов в зоне повреждения коры мозга реципиента может быть связано с формированием глиального барьера между тканями трансплантата и реципиента. Однако исследование структуры компактно расположенных клеточных трансплантатов показало, что их цитоархитектоника характеризуется хаотичностью, без какого-либо слоистого распределения пересаженных клеток. Степень упорядоченности трансплантированных нейронов приближалась к таковой у клеток нормальной коры мозга только при условии отсутствия глиального барьера между тканями донора и реципиента. В противном случае структура клеток трансплантата была атипичной, а сами нейроны подвергались гипертрофии. С помощью нейроиммунохимического типирования пересаженных клеток в трансплантатах были обнаружены тормозные GABA-ергические нейроны к выявлена экспрессия белков PARV, CALB и NPY. Следовательно, в зрелом мозге сохраняются факторы микроокружения, способные поддерживать пролиферацию, миграцию и специфическую дифференцировку нейральных мультипотентных клеток.

В культуре стволовых клеток человека, выделенных из перивентрикулярной области мозга 9-недельных эмбрионов, М. Александрова и соавторы (2001) в четвертом пассаже обнаружили большое количество нестинпозитивных мультипотентных клеток, часть из которых уже подверглась дифференцировке in vitro и развивалась по нейрональному типу, что соответствовало результатам исследований других авторов. После трансплантации в мозг взрослых крыс культивированные стволовые клетки человека митотически делились и мигрировали в ткань ксеногенного мозга реципиента. В клеточных трансплантатах авторы наблюдали две популяции клеток - мелкие и более крупные. Последние мигрировали как в паренхиме, так и по волоконным структурам мозга реципиента на незначительные расстояния - в пределах 300 мкм. Наибольшая протяженность пути миграции (до 3 мм) была характерна для мелких клеток, часть которых дифференцировалась в астроциты, что было установлено с помощью моноклональных антител к GFAP. Оба типа клеток обнаруживались в стенке латерального желудочка, что свидетельствовало о выходе трансплантированных клеток на ростральный миграционный тракт. Астроцитарные производные нейральных стволовых клеток как человека, так и крысы мигрировали преимущественно по кровеносным капиллярам и волоконным структурам мозга реципиента, что совпадает с данными других авторов.

Анализ дифференцировки стволовых клеток человека in vivo с помощью моноклональных антител к GFAP, CALB и VIM выявил образование как астроцитов, так и нейронов. В отличие от клеток крысиных трансплантатов, многие стволовые клетки человека были виментинположительными. Следовательно, часть мультипотентных клеток человека не подвергалась дифференцировке. В дальнейшем те же авторы показали, что нейральные стволовые клетки человека, пересаженные без применения иммуносупрессии, переживают после трансплантации в мозге крысы в течение 20 суток при отсутствии признаков иммунной агрессии со стороны глиальных элементов зрелого мозга.

Установлено, что даже нейральные стволовые клетки дрозофилы приживляются и подвергаются дифференцировке в головном мозге настолько отдаленного от насекомых таксона, как крыса. Корректность эксперимента авторов не вызывает сомнений: трансгенные линии дрозофилы содержали гены нейротрофических факторов человека NGF, GDNF, BDNF, инсертированные в вектор CaSper под дрозофилиным хит-шоковым промотором, так что температура тела млекопитающих автоматически вызывала их экспрессию. Авторы идентифицировали клетки дрозофилы по продукту гена бактериальной галактозидазы с помощью гистохимического X-Gal окрашивания. Кроме того, оказалось, что нейральные стволовые клетки дрозофилы специфически реагируют на нейротрофические факторы, кодируемые генами человека: при ксенотрансплантации клеток трансгенной линии дрозофилы, содержащей ген gdnf, в ее дифференцирующихся стволовых нервных клетках резко повышался синтез тирозингидроксилазы, а клетки с геном ngf активно продуцировали ацетилхолинэстеразу. Аналогичные гензависимые реакции ксенотрансплантат индуцировал в пересаживаемом вместе с ним аллотрансплантате эмбриональной нервной ткани.

Означает ли это, что специфическая дифференцировка нейральных стволовых клеток индуцируется видонеспецифичными нейротрофическими факторами? По результатам авторов, ксенотрансплантат, продуцирующий нейротрофические факторы, оказывал специфический эффект на судьбу аллотрансплантатов, которые в этом случае развивались более интенсивно и в 2-3 раза превосходили по размерам аллотрансплантаты, введенные в мозг без добавления ксенотрансплантатов. Следовательно, клетки ксенотрансплантата, содержащие гены нейротрофинов, в частности ген, кодирующий глиальный нейротрофический фактор (GDNF) человека, оказывают на развитие аллотрансплантата видонеспецифический эффект, подобный действию соответствующего нейротрофина. Известно, что GDNF повышает выживаемость дофаминергических нейронов эмбрионального среднего мозга крыс и усиливает метаболизм дофамина этими клетками, а также индуцирует дифференцировку позитивных по тирозингидроксилазе клеток, усиливая рост аксонов и увеличивая размеры тела нейронов. Подобные эффекты наблюдаются и в культуре дофаминергических нейронов среднего мозга крысы.

После ксенотрансплантации нейральных стволовых клеток человека в мозг половозрелых крыс отмечается их активная миграция. Известно, что процесс миграции и дифференцировки нейральных стволовых клеток контролируется набором специальных генов. Инициирующий миграционный сигнал клетке-предшественнику к началу дифференцировки дает белковый продукт протоонкогена с-ret совместно с GDNF. Следующий сигнал поступает от гена mash-1, который управляет выбором пути развития клетки. Кроме того, специфическая реакция дифференцирующихся клеток зависит также от а-рецептора цилиарного нейротрофического фактора. Таким образом, учитывая совершенно разную генетическую конституцию ксеногенных нейральных стволовых клеток человека и клеток мозга реципиента-крысы, следует признать не только видонеспецифичность нейротрофических факторов, но и высочайший эволюционный консерватизм генов, отвечающих за специфическую дифференцировку нейральных стволовых элементов.

Станет ли возможной ксенотрансплантация эмбрионального нейроматериала в нейрохирургической практике лечения нейродегенеративных патологических процессов, обусловленных нарушением синтеза миелина олигодендроцитами, покажет будущее. Пока же наиболее интенсивно решаются вопросы нейротрансплантации, связанные с получением из эмбрионального или зрелого мозга аллогенных нейральных стволовых клеток в культуре с последующей их направленной дифференцировкой в нейробласты или специализированные нейроны.

Трансплантация нейральных стволовых клеток

Для стимуляции пролиферации и дифференцировки нейральных стволовых клеток взрослого организма можно трансплантировать эмбриональную нервную ткань. При этом не исключено, что привносимые с аллотрансплантатом стволовые клетки нервной ткани эмбриона сами могут подвергаться пролиферации и дифференцировке. Известно, что после спинальной травмы регенерация нервных проводников осуществляется посредством удлинения поврежденных аксонов и коллатерального спраутинга аксонов неповрежденных отростков мотонейронов. Основными факторами, препятствующими регенерации спинного мозга, являются образование соединительнотканного рубца в зоне повреждения, дистрофические и дегенеративные изменения в центральных нейронах, дефицит NGF, а также наличие в зоне поражения продуктов распада миелина. Показано, что трансплантация в поврежденный спинной мозг разных типов клеток - фрагментов седалищного нерва взрослых животных, эмбриональной затылочной коры, гиппокампа, спинного мозга, шванновских клеток, астроцитов, микроглии, макрофагов, фибробластов - способствует регенерации поврежденных аксонов путем спраутинга и позволяет новообразованным аксонам прорастать сквозь зону повреждения спинного мозга. Экспериментально доказано, что трансплантация эмбриональной нервной ткани в область повреждения спинного мозга посредством действия нейротрофических факторов ускоряет рост пораженных аксонов, препятствует образованию глиального рубца и развитию дистрофических и дегенеративных процессов в центральных нейронах, в то время как клетки трансплантированной эмбриональной нервной ткани переживают в спинном мозге, интегрируются с прилежащими тканями и способствуют прорастанию аксонов через область поражения с формированием синапсов дендритического типа на спинальных нейронах.

Данное направление регенеративно-пластической медицины получило наибольшее развитие в Украине благодаря работе научного коллектива под руководством В.И. Цымбалюка. Прежде всего, это экспериментальные исследования эффективности трансплантации эмбриональной нервной ткани при повреждениях спинного мозга. При аутотрансплантации периферического нерва наиболее выраженные изменения деструктивного характера авторы наблюдали в зоне дистального шва, где на 30-е сутки после операции они сочетались с процессами репаративного характера. При аллотрансплантации морфофункциональное состояние имплантированного нерва на 30-й день характеризовалось выраженной деструкцией с явлениями жирового перерождения и амилоидоза на фоне очаговой воспалительной лимфоидноклеточной инфильтрации с преобладающей атрофией шванновских клеток. Трансплантация эмбриональной нервной ткани в большей степени способствовала восстановлению проводимости спинного мозга, особенно у животных, которым операция проводилась на протяжении первых 24 часов после травмы: на фоне уменьшения интенсивности воспалительно-деструктивных процессов отмечались гипертрофия и гиперплазия белоксинтезирующих и энергопродуцирующих ультраструктурных элементов спинальных нейронов, гипертрофия и гиперплазия олигодендроцитов, на 50% восстанавливалась амплитуда потенциала действия мышцы и на 90% - скорость проведения импульса. При оценке эффективности трансплантации эмбриональной нервной ткани в зависимости от зоны пересадки было установлено, что лучшие результаты наблюдаются при введении трансплантата непосредственно в зону повреждения спинного мозга. При полном пересечении спинного мозга трансплантация эмбриональной нервной ткани оказалась неэффективной. Динамические исследования показали, что оптимальным сроком для выполнения трансплантации эмбриональной нервной ткани являются первые 24 часа после травмы спинного мозга, тогда как проведение операции в период выраженных вторичных ишемично-воспалительных изменений, возникающих на 2-9-е сутки после травмы, следует признать нецелесообразным.

Известно, что тяжелая черепно-мозговая травма провоцирует мощную и длительную активацию пероксидного окисления липидов на начальных и промежуточных этапах посттравматического периода как в поврежденной мозговой ткани, так и в организме в целом, а также нарушает процессы энергетического метаболизма в травмированном мозге. В этих условиях трансплантация эмбриональной нервной ткани в область травматического повреждения способствует стабилизации процессов липопероксидации и повышает потенциал антиоксидантной системы мозга и организма в целом, усиливает его антирадикальную защиту на 35-60-е сутки посттравматического периода. В те же сроки после трансплантации эмбриональной нервной ткани нормализуется энергетический метаболизм и процессы окислительного фосфорилирования в головном мозге. Кроме того, показано, что на первый день после экспериментальной черепно-мозговой травмы импеданс ткани травмированного полушария уменьшается на 30-37%, контрлатерального - на 20%, что свидетельствует о развитии генерализованного отека мозга. У животных, которым выполняли трансплантацию эмбриональной нервной ткани, инволюция отека происходила значительно быстрее - уже на седьмые сутки среднее значение импеданса тканей травмированного полушария достигало 97,8% от контрольного уровня. Причем полное восстановление величин импеданса на 30-е сутки отмечалось только у животных, которым трансплантировали эмбриональную нервную ткань.

Гибель части нейронов мозга после тяжелой черепно-мозговой травмы является одной из основных причин развития посттравматических осложнений. Особенно чувствительны к травме нейроны интегрирующих дофаминергической и норадренергической систем среднего и продолговатого мозга. Снижение уровня дофамина в стриопаллидарном комплексе и коре больших полушарий существенно повышает риск развития двигательных нарушений и психических расстройств, эпилептиформных состояний, а уменьшение продукции дофамина в гипоталамусе может быть причиной многочисленных вегетативных и соматических нарушений, наблюдающихся в отдаленном посттравматическом периоде. Результаты проведенных исследований при экспериментальной черепно-мозговой травме свидетельствуют о том, что пересадка эмбриональной нервной ткани способствует восстановлению содержания дофамина в травмированном полушарии мозга, дофамина и норадреналина - в гипоталамусе, а также повышению уровней норадреналина и дофамина в среднем и продолговатом мозге. Кроме того, в результате трансплантации эмбриональной нервной ткани в травмированном полушарии мозга экспериментальных животных нормализуется процентное соотношение фосфолипидов и повышается содержание жирных кислот (С16:0, С17:0, С17:1, С18:0, С18:1 + С18:2, С20:3 + С20:4, С20:5).

Эти данные подтверждают стимуляцию регенеративно-пластических процессов трансплантированной эмбриональной нервной тканью и свидетельствуют о репаративно-трофическом влиянии трансплантата на мозг реципиента в целом.

Особого внимания заслуживает клинический опыт сотрудников Института нейрохирургии им. А.П. Ромоданова АМН Украины по трансплантации эмбриональной нервной ткани при детском церебральном параличе - крайне сложной патологии с грубыми нарушениями двигательной функции. Клинические формы детского церебрального паралича зависят от уровня повреждения интегральных структур, отвечающих за регуляцию мышечного тонуса и формирование двигательных стереотипов. В настоящее время имеется достаточно доказательств в пользу того, что в нарушениях двигательных функций и мышечного тонуса важную роль играют патологические изменения в системе стриопаллидо-таламокортикального моторного контроля. Стриопаллидарное звено этой системы осуществляет контролирующую функцию через нигростриарную продукцию дофамина. Прямой путь реализации таламокортикального контроля начинается от нейронов скорлупы, опосредуется гаммааминомасляной кислотой (ГАМК) и субстанцией Р и проецируется непосредственно в моторную зону внутреннего сегмента бледного шара и черной субстанции. Непрямой путь, эффект которого реализуется с участием ГАМК и энкефалина, берет начало от нейронов скорлупы и оказывает влияние на ядра базальных ганглиев через последовательность соединений, включающих внешний сегмент бледного шара и субталамическое ядро. Нарушения проводимости прямого пути вызывают гипокинезию, тогда как снижение проводимости структур непрямого пути приводит к гиперкинезии с соответствующими изменениями мышечного тонуса. Целостность ГАМК-ергических проводящих путей на разных уровнях в системе моторного контроля и интеграция дофаминергических связей на уровне скорлупы имеют существенное значение для регуляции таламокортикальных взаимодействий. Наиболее общим проявлением двигательной патологии при различных формах детского церебрального паралича является нарушение мышечного тонуса и тесно связанное с ним изменение рефлекторной активности мышц.

Трансплантация эмбриональной нервной ткани при детском церебральном параличе требует тщательного анализа характера повреждений мозговых структур. На основании определения содержания дофамина и ГАМК в субарахноидальном ликворе авторы детализировали уровень нарушения интеграции функциональных структур мозга, что дало возможность объективизировать результаты оперативного вмешательства и скорректировать повторные нейротрансплантации. Эмбриональную нервную ткань (абортный материал 9-недельного зародыша) трансплантировали в паренхиму коры прецентральных извилин полушарий головного мозга в зависимости от степени выраженности атрофических изменений. В послеоперационном периоде осложнений или ухудшения состояния больных не наблюдалось. Позитивная динамика отмечалась у 63% больных со спастическими формами, у 82% детей с атонически-астетической формой и только у 24% больных со смешанной формой заболевания. Установлено негативное влияние на результаты операции высокого уровня нейросенсибилизации с наличием аутоантител к нейроспецифическим белкам. Малоэффективной трансплантация эмбриональной нервной ткани оказалась у больных в возрасте 8-10 лет и старше, а также при выраженном гиперкинетическом синдроме и эписиндроме. Клинически эффективность пересадки эмбриональной нервной ткани у больных со спастическими формами детского церебрального паралича проявлялась формированием новых статомоторных навыков и произвольных движений с коррекцией патологического двигательного стереотипа и уменьшением степени спастичности, патологических поз и установок. Авторы считают, что позитивный эффект трансплантации эмбриональной нервной ткани является результатом нормализующего влияния на функциональную активность супраспинальных структур, участвующих в регуляции тонуса поз и произвольных движений. При этом позитивные клинические эффекты трансплантации эмбриональной нервной ткани сопровождаются снижением содержания нейромедиаторов в субарахноидальном ликворе, что свидетельствует о восстановлении интегральных взаимодействий пораженных структур мозга.

Существует еще одна тяжелейшая форма неврологической патологии - апаллический синдром, проблема лечения которого, к сожалению, далека от решения. Апаллический синдром представляет собой полиэтиологичное подострое или хроническое состояние, возникающее в результате тяжелых органических поражений ЦНС (преимущественно коры больших полушарий), и характеризуется развитием панапраксии и панагнозии при относительно сохраненной функции сегментарно-стволовых отделов и образований лимбико-ретикулярного комплекса головного мозга. Катамнестические исследования (от 1 года до 3 лет) показали, что апаллический синдром не является конечным диагнозом стойкого поражения нервной системы у детей, а трансформируется либо в органическую деменцию, либо в хроническое вегетативное состояние. В отделении восстановительной нейрохирургии Института нейрохирургии им. А.П. Ромоданова АМН Украины 21 больному с последствиями апаллического синдрома была выполнена трансплантация эмбриональной нервной ткани. Под общей анестезией корончатой фрезой накладывали фрезевое отверстие над зоной наиболее выраженных атрофических изменений, выявленных при компьютерной или магнитно-резонансной томографии, а при наличии диффузной атрофии серого или белого вещества трансплантат вводили в прецентральную и центральную извилины головного мозга. После вскрытия твердой мозговой оболочки кусочки ткани закладки сенсомоторной коры 8-9-недельныХ эмбрионов имплантировали интракортикально с помощью специального устройства. Количество образцов имплантированной ткани составляло от 4 до 10, что определялось величиной фрезевого отверстия и размерами местных изменений мозгового вещества. В отличие от других видов патологии, при апаллическом синдроме авторы стремились имплантировать как можно больше эмбриональной ткани в максимально доступные зоны мозга. Твердую мозговую оболочку ушивали, производили пластику дефекта черепа. Во время операции у всех больных наблюдались выраженные изменения как со стороны коры (атрофия, отсутствие извилин, изменение цвета и пульсации мозгового вещества), так и оболочек мозга (утолщение твердой мозговой оболочки, значительное утолщение арахноидальной оболочки с наличием в ней собственных кровеносных сосудов, сращение оболочек с подлежащим мозговым веществом). Эти изменения были более выражены у больных, в анамнезе которых имелись указания на перенесенные воспалительные поражения головного мозга. У больных, перенесших гипоксию ЦНС, преобладали диффузные атрофические изменения мозгового вещества, особенно корковых отделов, с увеличением подпаутинного пространства, без выраженных изменений со стороны оболочек головного мозга. У половины больных отмечалась повышенная кровоточивость мягких тканей, костей, мозгового вещества. После операций в сроки от шести месяцев до трех лет состояние улучшилось у 16 пациентов, у пяти больных осталось без изменений. Позитивная динамика наблюдалась как со стороны двигательной, так и психической сферы. Мышечный тонус снизился у десяти больных, у И пациентов возросла двигательная активность (уменьшился парез, улучшилась координация движений), у пяти детей заметно повысилась манипулятивная способность верхних конечностей. У четырех больных снизилась частота и выраженность эпилептических припадков, а у одного ребенка за весь период наблюдения после операции припадков не было вообще. Агрессивность уменьшилась у двух детей, у двух больных с выраженными бульбарными нарушениями улучшился акт глотания, два ребенка смогли самостоятельно жевать уже через 2 недели после операции. Отмечено уменьшение выраженности психических расстройств, девять детей после операции стали более спокойными, сон и внимание улучшились у семи пациентов. Трое больных с последствиями апаллического синдрома начали узнавать своих родителей, один - выполнять инструкции, двое - произносить слова, у троих снизилась степень дизартрии. Авторы отмечают, что заметное улучшение состояния больных начинается через 2 месяца после операции, достигает максимума к 5-6 месяцам, затем темп улучшения замедляется и к концу года у 50% больных процесс стабилизируется. Положительный эффект нейротрансплантации послужил основанием для проведения повторной операции у шести больных с последствиями апаллического синдрома, но на другом полушарии головного мозга. Техника и методика второй трансплантации были идентичны таковым при первой операции, однако клинический эффект второй операции оказался ниже, хотя как после первого, так и после второго оперативного вмешательства серьезных осложнений не возникало. По мнению авторов, механизм лечебного действия нейротрансплантации связан с нейротрофическим влиянием пересаженной эмбриональной нервной ткани, которая содержит большое количество ростовых, гормональных и других биологически активных веществ, стимулирующих репарацию поврежденных нейронов и пластическую реорганизацию ткани мозга реципиента. Не исключается и активирующие влияние на деятельность нервных клеток, которые до этого были морфологически сохранены, но вследствие заболевания утратили функциональную активность. Именно быстрым нейротрофическим действием можно объяснить улучшение бульбарных функций у некоторых детей уже в конце первой-второй недели после операции. Допускается, что наряду с этим к третьему-четвертому месяцу между трансплантатом и мозгом хозяина устанавливаются морфофункциональные связи, посредством которых нейротрансплантат замещает функции погибших клеток мозга, что и является субстратом для улучшения как двигательных, так и психических функций больных.

Влияние трансплантата эмбриональной нервной ткани на реорганизацию межнейронных взаимосвязей изучалось экспериментально. Авторы на белых крысах с помощью флюоресцентной липофильной метки DIL (1,1-диоктадецил-3,3,3\3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат) и конфокального лазерного сканирования исследовали закономерности восстановления межмодульных аксонных связей в зоне механического повреждения коры большого мозга на фоне трансплантации эмбриональной нервной ткани и без нее. Установлено, что введение эмбриональной нервной ткани в зону повреждения обеспечивает рост аксонов, которые после прохождения через трансплантат соединяются с прилегающей тканью мозга, тогда как без трансплантации эмбриональной нервной ткани зона повреждения является для растущих аксонов непреодолимым препятствием. В этой работе проводилась трансплантация эмбрионального (15-17-е сутки гестации) неокортекса. Полученные авторами результаты - еще одно свидетельство в пользу активного влияния трансплантата эмбриональной нервной ткани на посттравматическую реорганизацию межнейронных взаимоотношений соседних структурно-функциональных модулей коры большого мозга. Трансплантация эмбриональной нервной ткани обеспечивает частичное восстановление связей между разделенными повреждением участками коры большого мозга за счет создания благоприятных условий для роста аксонов в зоне действия нейротрофичёских факторов трансплантата. Существование подобного эффекта доказано экспериментально и обсуждается в литературе как свидетельство высоких пластических возможностей поврежденного мозга половозрелых животных. В связи с этим, клеточная трансплантация рассматривается в настоящее время в качестве оптимальной терапевтической стратегии восстановления функции поврежденной ЦНС человека.

Полученные авторами данные об эффективности использования эмбриональной нервной ткани мозга в качестве экзогенной трансплантационной среды для роста аксонов служат подтвержденим перспективности целенаправленного создания коммуникационных связей между неповрежденными соседними участками мозга. Актуальной представляется работа по изучению влияния трансплантации нервной ткани на динамику функциональных параметров ЦНС, задачей которой было исследовать воздействие трансплантации эмбриональной закладки locus coeruleus (LC) на морфофункциональные показатели нейронов LC и локомоторную активность реципиентов. Реципиентами были самки крыс линии Вистар, донорами - 18-суточные эмбрионы крыс той же линии. Пересадку эмбрионального LC проводили в полость третьего желудочка головного мозга. Гистологически приживление трансплантата выявлено у 75% животных-реципиентов. В случаях приживления трансплантат прилегал к стенке желудочка, заполняя 1/5-2/5 его просвета, и был жизнеспособен. Через 1 и 6 месяцев после операции пересаженная нервная ткань по морфологическим характеристикам представляла структуры, которые возникли бы при их нормальном онтогенетическом развитии, то есть, структуры LС. Полученные авторами данные свидетельствуют о том, что у животных, которым была пересажена эмбриональная закладка ЬС, изменяется динамическая активность и увеличивается матричная активность хроматина ядер клеток LС. Следовательно, происходит интенсификация деятельности нейронов собственных LС, но и прижившийся трансплантат тоже является функционально активным. Известно, что так называемая локомоторная область среднего мозга практически совпадает с локализацией ЬС. Авторы считают, что в основе изменения двигательной активности крыс-реципиентов лежит активация клеток LС, как собственных, так и трансплантата, с выделением в итоге большого количества норадреналина, в том числе и в сегментах спинного мозга. Таким образом, предполагается, что повышение двигательной активности в условиях трансплантации LС в интактный мозг животных обусловлено присутствием функционально активного трансплантата, интегрированного с головным мозгом реципиента и вносящего свой вклад в активацию локомоторной активности крыс.

Кроме того, показано, что пересаженные нейроэпителиальные клетки эмбриональных закладок неокортекса и спинного мозга выживают и дифференцируются в нейробласты, молодые и зрелые нейроны в течение 1-2 месяцев после их трансплантации в поврежденный седалищный нерв половозрелых крыс. При исследовании динамики развития NADРН-положительных нейронов эмбриональных закладок неокортекса и спинного мозга крыс в гетеротопических аллотрансплантатах (15- суточный эмбрион крысы), на продольных срезах через седалищные нервы крыс-реципиентов выявлено приживление от 70 до 80% нейротрансплантатов, что зависело от сроков наблюдения. Нейробласты уни- и биполярной формы с округлыми светлыми ядрами и одним-двумя ядрышками начинали формироваться в трансплантатах через одну неделю после операции, что сопровождалось образованием кластеров. Среди нейробластов авторам не удалось обнаружить клетки, содержащие NADPH-диaфopaзy (NADPH-d). Через 7 суток NADPH-положительными оказались лишь клеточные элементы кровеносных сосудов - эндотелиоциты капилляров в толще трансплантата, а также эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов седалищного нерва реципиента. Поскольку в гладкомышечных клетках сосудов индукция NO-синтазы (NOS) происходит под влиянием IL-1, авторы связывают появление NADPH-позитивных гладкомышечных клеток в кровеносных сосудах седалищного нерва с присутствием IL-1, синтезируемого в поврежденных нервных стволах. Известно, что нейроногенез в условиях трансплантации эмбриональных закладок мозга осуществляется синхронно с развитием нейронов in situ. Результаты морфологических исследований свидетельствуют о том, что дифференцировка части нейральных элементов трансплантатов через семь суток после пересадки соответствует дифференцировке клеток аналогичных отделов мозга новорожденных крыс. Таким образом, в условиях гетеротопической трансплантации в периферический нерв пересаженные нервные клетки эмбриона проявляют способность синтезировать NADPH-d. При этом в трансплантатах спинного мозга обнаруживается больше нейронов, содержащих NADPH-d, чем в трансплантатах неокортекса, однако синтез оксида азота начинается в трансплантированных нейронах позже, чем при развитии in situ. В ЦНС позвоночных NOS-позитивные клетки появляются уже в пренатальный период. Считается, что NO способствует образованию синаптических связей в развивающемся мозге, а присутствие NOS-положительных нервных афферентных волокон, обеспечивающих синтез NO в нейробластах мозжечка, стимулирует миграцию и дифференцировку нейронов, благодаря чему формируется нормальная цитоархитектоника мозга. Важная роль NO в синапсогенезе установлена в тектуме - NOS-положительными оказались только те нейроны, которые имели синаптические связи с клетками сетчатки.

Известно, что оксид азота является одним из регуляторов деятельности мозга, где он образуется из аргинина под влиянием NO-синтазы, обладающей диафоразной активностью. В ЦНС N0 синтезируется в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, микроглии, астроцитах и в нейронах различных отделов мозга. После травматического повреждения мозга, а также при гипоксии и ишемии наблюдается увеличение количества нейронов, содержащих NO, который является одним из регуляторов мозгового кровотока. Учитывая способность N0 индуцировать синапсогенез, исследование образования NO-содержащих клеток в условиях нейротрансплантации на фоне травматических повреждений нервной ткани реципиента представляют особый интерес.

Не менее важно изучение влияния нейротрансплантации на условно-рефлекторный стереотип поведения. В экспериментах по исследованию воздействия внутримозговой и дистантной (между СII и СIII) пересадки ткани эмбрионального голубоватого пятна (17-19-е сутки гестации) на процессы памяти и содержание катехоламинов у крыс с разрушением лобно-височного неокортекса показано, что электролитическое повреждение лобно-височной коры головного мозга нарушает стереотип условно-рефлекторной эмоциональной реакции избегания (память), ослабляет физиологическую активность, снижает содержание норадреналина в зоне коагулированного неокортекса, но повышает его уровень в гипоталамусе, где наблюдается уменьшение концентрации адреналина, хотя в крови и надпочечниках его количество возрастает.

В результате внутримозговой трансплантации ткани эмбрионального голубоватого пятна у 81,4% животных восстанавливается стереотип условно-рефлекторной эмоциональной реакции избегания, нарушенный электролитическим повреждением лобно-височных отделов коры головного мозга, нормализуется содержание адреналина в ретикулярной формации среднего мозга, гипоталамусе и неокортексе, а в гиппокампе даже повышается его уровень, что сочетается со снижением концентрации адреналина в крови.

Дистантная трансплантация ткани эмбрионального голубоватого пятна способствует не только восстановлению нарушенного стереотипа условно-рефлекторной эмоциональной реакции избегания у крыс с электролитическим поражением фронтотемпоральной коры головного мозга, но и повышает содержание норадреналина и адреналина, преимущественно в гипоталамусе, крови, надпочечниках и сердце. Предполагается, что это связано с васкуляризацией трансплантата, проникновением нейромедиаторов в кровеносное русло, прохождением их через гематоэнцефалический барьер и активацией механизмов обратного захвата адреналина и норадреналина по типам uptake 1, 2, 3. Авторы считают, что длительную стабилизацию уровня норадреналина в условиях приживления и функционирования трансплантата можно рассматривать как феномен его поступательного высвобождения в минимальных дозах нейронами голубоватого пятна.

Позитивные клинические эффекты трансплантации эмбриональной нервной ткани могут быть обусловлены и способностью последней влиять на процессы новообразования сосудов, в регуляции которых непосредственное участие принимают факторы роста и цитокины. Активируют васкулогенез ангиогенные факторы роста - сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), FGF, PDGF и TGF, которые синтезируются при ишемии, выступающей инициирующим моментом ангиогенеза. Доказано, что истощение потенциала сосудистого роста происходит в процессе старения организма, что играет существенную роль в патогенезе таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца и облитерирующий атеросклероз нижних конечностей. Ишемия тканей развивается и при множестве других заболеваний. Введение ангиогенных факторов в зоны ишемии (терапевтический ангиогенез) стимулирует рост кровеносных сосудов в ишемизированных тканях и улучшает микроциркуляцию за счет развития коллатерального кровообращения, что, в свою очередь, повышает функциональную активность пораженного органа.

Наиболее перспективными для клинического применения считаются VEGF и FGF. Результаты первых рандомизированных исследований оказались обнадеживающими, особенно при условии правильного выбора оптимальных дозировок и способов введения ангиогенных факторов. В связи с этим проведена экспериментальная оценка ангиогенной активности экстракта, выделенного из эмбриональной мозговой ткани человека. В работе использовался абортный материал, полученный на двадцатой неделе беременности и обработанный по методике I. Maciog и соавторов (1979) в модификации ИЦ АНРФ. Данный препарат является аналогом “Endothelial cell growth supplement” (“Sigma”) и представляет собой естественную смесь ангиогенных факторов человека, в состав которой входят VEGF и FGF. Эксперименты выполнены на крысах с моделями ишемии ткани задней конечности и миокарда. На основании исследования активности щелочной фосфатазы у экспериментальных животных, получавших экстракт эмбриональной нервной ткани, выявлено увеличение количества капилляров на единицу площади миокарда - как на продольных, так и на поперечных срезах сердца. Ангиогенная активность препарата проявлялась при непосредственном введении в зону ишемии, а также в случае системного (внутримышечного) введения, что приводило к уменьшению средней площади постинфарктного рубца.

В любом варианте выполнения трансплантации эмбриональной нервной ткани чрезвычайно важно правильно подобрать гестационный срок трансплантируемого эмбрионального материала. Сравнительный анализ эффективности клеточных препаратов из эмбрионального вентрального мезэнцефалона 8-, 14- и 16-17-дневных эмбрионов крыс через три месяца после интрастриарной нейротрансплантации половозрелым крысам с паркинсонизмом в автоматизированном тесте апоморфининдуцированной двигательной асимметрии выявил достоверно более высокую эффективность клеточных препаратов ЦНС 8-суточных эмбрионов и наименьшую - из 16-17-суточной эмбриональной нервной ткани. Полученные данные коррелировали с результатами гистоморфологического анализа, в частности, с размерами трансплантатов, выраженностью глиальной реакции и количеством дофаминергических нейронов в них.

Различия терапевтического эффекта клеток эмбриональной нервной ткани могут быть связаны как со степенью незрелости и коммитированности самих клеток, так и с их различной реакцией на факторы роста, которые выделяются в зоне индуцированного повреждения дофаминергических нейронов. В частности, влияние EGF и FGF2 на развитие нейральных стволовых клеток телэнцефалона in vivo происходит на разных стадиях эмбриогенеза. Нейроэпителиальные клетки 8,5-суточных эмбрионов мыши при культивировании in vitro в бессывороточной среде пролиферируют в присутствии FGF2, но не EGF, на который реагируют только популяции стволовых клеток, изолированных из мозга эмбрионов на более поздних стадиях развития. В то же время нейральные стволовые клетки пролиферируют в ответ на каждый из этих митогенов и аддитивно усиливают рост в случае добавления EGF и FGF2 в культуру с низкой плотностью посадки клеток. Считается, что EGF-реактивные нейральные стволовые клетки зародышевых зон 14,5-суточных эмбрионов мыши являются линейными потомками FGF-реактивных нейральных стволовых клеток, которые впервые появляются через 8,5 суток гестации. Потенциальный фенотип нейральных стволовых и прогениторных клеток зависит от комплексного воздействия их микроокружения. При иммунофенотипировании нейральных клеток перивентрикулярной и гиппокампальной зон 8-12- и 17-20-недельных эмбрионов человека методом проточной цитофлюорометрии выявлена значительная вариабельность, связанная как со сроком гестации, так и с индивидуальными конституциональными особенностями донорского биоматериала. При культивировании этих нейральных клеток-предшественников в селективной бессывороточной среде с EGF, FGF2 и NGF формируются нейросферы со скоростью, существенно зависящей от срока гестации. Клетки различных участков головного мозга 5-13-недельного эмбриона человека при кратковременной культивации с FGF2 в монослойной культуре на ламининовом субстрате в присутствии следовых количеств ростовых факторов поддерживают пролиферацию в течение 6 недель с высоким процентом нестинпозитивных клеток на фоне спонтанного образования клеток с маркерами всех трех линий нейральной дифференцировки. Клетки, изолированные из мезэнцефалона зародыша человека при сроке гестации, превышающем 13 недель, пролиферируют под воздействием EGF и также образуют нейросферы. Благодаря применению комбинации EGF и FGF2 был достигнут синергический эффект. Наиболее интенсивная пролиферация нейральных стволовых клеток с возникновением нейросфер наблюдается при культивировании ткани коры головного мозга 6-8-недельных эмбрионов человека в присутствии EGF2, IGF1 и 5% лошадиной сыворотки на подложке с фибронектином.

Следует заметить, что вопросы, касающиеся срока гестации и отдела эмбриональной ЦНС, ткань которого предпочтительнее использовать с целью нейротрансплантации, остаются открытыми. Ответы на них следует искать в нейрогенезе развивающегося мозга, который продолжается на протяжении всего пренатального периода - в сроки, когда эпителий нервной трубки образует многослойную структуру. Считается, что источником стволовых клеток и новых нейронов является радиальная глия, состоящая из вытянутых клеток с длинными отростками, радиально направленными по отношению к стенке мозговых пузырей, и контактирующими с внутренней поверхностью желудочков и наружной пиальной поверхностью стенки мозга. Ранее радиальную глию наделяли лишь функцией нейронального тракта, по которому осуществляется миграция нейробластов из вентральной области в поверхностные отделы, а также отводили ей каркасную роль в процессе формирования правильной ламинарной организации коры. Сегодня установлено, что по мере развития радиальная глия трансдифференцируется в астроциты. Значительная ее часть у млекопитающих редуцируется сразу после рождения, однако у тех видов животных, у которых радиальная глия сохраняется до зрелого возраста, нейроногенез активно протекает и в постнатальном периоде.

В культуре клетки радиальной глии из эмбрионального неокортекса грызунов образовывали нейроны и глиальные клетки, причем на гестационном сроке развития зародышей от 14 до 16 дней (период максимальной интенсивности нейроногенеза в коре головного мозга мышей и крыс) формировались преимущественно нейроны. На 18-е сутки эмбриогенеза дифференцировка смещалась в сторону образования астроцитов при значительном уменьшении числа новообразованных нейронов. Маркировка in situ клеток радиальной глии с помощью GFP позволила обнаружить в полости мозговых пузырей 15-16-суточных зародышей крысы асимметричное деление меченых клеток с появлением дочерних клеток, имеющих иммунологические и электрофизиологические характеристики нейробластов. Примечательно, что, по результатам динамических наблюдений, возникшие нейробласты используют материнскую клетку радиальной глии для миграции к пиальной поверхности.

Эндогенным маркером радиальной глии является белок промежуточных филаментов нестин. Методом флюоресцентной проточной сортировки клеток, меченых ретровирусом, связанным с GFP и экспрессирующимся под контролем нестина, показано, что стволовые клетки области зубчатой извилины и хилуса гиппокампа человека (материал был получен при операциях по поводу эпилепсии) экспрессируют нестин. Следовательно, они относятся к радиальной глие, которая у человека, как и у других млекопитающих, сохраняется только в зубчатой извилине.

Вместе с тем, эффективность клеточной трансплантации определяется не только высокой жизнеспособностью донорских клеток, их дифференцировочным потенциалом и свойством замещать дефектные клетки, но, в первую очередь, направленной миграцией. Именно от миграционной способности зависит полноценная функциональная интеграция трансплантированных клеток - без нарушений цитоархитектоники мозга реципиента. Поскольку радиальная глия в постнатальном периоде почти полностью подвергается редукции, следовало выяснить, каким образом у взрослых реципиентов донорские клетки могут перемещаться из зоны трансплантации в очаг повреждения головного мозга. Существует два варианта миграции клеток в ЦНС, не зависящие от радиальной глии: феномен тангенциальной миграции или перемещение нейробластов в процессе развития коры головного мозга перпендикулярно сети радиальной глии, а также миграция "вереницей" или "по цепочке". В частности миграция нейральных клеток-предшественников из ростральной субвентрикулярной зоны в обонятельную луковицу происходит в виде последовательности плотно прилегающих друг к другу клеток, окруженных клетками глии. Считается, что эти клетки используют клетки-партнеры в качестве миграционного субстрата, а основным регулятором таких межклеточных взаимодействий является PSA-NCAM (полисиалированная молекула адгезии нервных клеток). Следовательно, миграция нейронов не обязательно требует участия радиальной глии или предсуществующих аксональных связей. Внерадиальная форма перемещения клеток “вереницей” по ростральному миграционному тракту поддерживается в течение всей жизни, что указывает на реальную возможность адресной доставки трансплантируемых нейральных клеток-предшественников в зрелую нервную систему.

Существует гипотеза о наличии линии стволовых клеток в онтогенезе головного мозга, согласно которой на ранних стадиях развития мозга стволовой клеткой является клетка нейроэпителия, которая по мере созревания трансдифференцируется в радиальную глию. В зрелом возрасте роль стволовых клеток выполняют клетки, имеющие признаки астроцитов. Несмотря на ряд спорных моментов (противоречия в отношении стволовых клеток гиппокампа, а также глубоких отделов мозга, не имеющих слоистого строения коры и развивающихся из таламических бугров, где радиальная глия отсутствует), четкая и простая концепция о последовательной смене фенотипа стволовых клеток на протяжении онтогенеза выглядит весьма привлекательно.

Воздействие факторов микроокружения на детерминацию и последующую дифференцировку клеток нейрального дифферона четко продемонстрировано при трансплантации стволовых клеток зрелого спинного мозга крысы в разные отделы зрелой нервной системы. При пересадке стволовых клеток в зубчатую извилину или в область миграции нейронов обонятельных луковиц наблюдалось активное перемещение трансплантированных клеток с образованием многочисленных нейронов. Пересадка стволовых клеток в спинной мозг и область аммонова рога приводила к образованию астроцитов и олигодендроцитов, тогда как при трансплантации в зубчатую извилину формировались не только глиальные клетки, но и нейроны.

У половозрелой крысы число делящихся клеток в зубчатой извилине может достигать нескольких тысяч в сутки - меньше 1% от общего числа клеток-зерен. На долю нейронов приходится 50-90% клеток, астоцитов и иных глиальных элементов - около 15%. Остальные клетки не имеют антигенных признаков нейронов и глии, однако содержат антигены эндотелиальных клеток, что свидетельствует о тесной взаимосвязи нейроногенеза и ангиогенеза в зубчатой извилине. Сторонники возможности дифференцировки эндотелиальных клеток в клетки-предшественники нейронов ссылаются на способность эндотелиоцитов in vitro синтезировать BDNF.

Впечатляет скорость самосборки нейронных цепей: в процессе дифференцировки клетки-предшественники клеток-зерен мигрируют в зубчатую извилину и образуют отростки, растущие в сторону зоны САЗ аммонова рога и формирующие синапсы с пирамидными глутаматергическими и вставочными тормозными нейронами. Вновь созданные клетки-зерна встраиваются в существующие нейронные цепи в течение 2 недель, а первые синапсы появляются уже на 4-6-е сутки после возникновения новых клеток. Путем частого введения зрелым животным BrdU или 3Н-тимидина (один из способов выявления взрослых стволовых клеток) обнаружено большое количество меченых нейронов и астроцитов в аммоновом роге, что свидетельствует о возможности образования новых нейронов не только в зубчатой извилине, но и в других отделах гиппокампа. Интерес к процессам деления, дифференцировки и гибели клеток в зубчатой извилине гиппокампа зрелого мозга обусловлен еще и тем, что формирующиеся здесь нейроны локализуются в одном из ключевых мест гиппокампа, отвечающего за процессы обучения и памяти.

Итак, на сегодня установлено, что из клеток субэпендимной зоны бокового желудочка зрелых грызунов происходят нейральные клетки-прешественники, мигрирующие по ростральному миграционному тракту, образованному продольно ориентированными клетками астроглии, до обонятельной луковицы, где они встраиваются в слой клеток-зерен и дифференцируются в нейроны этой структуры. Миграция прогениторных нейральных клеток выявлена в ростральном миграционном тракте взрослых обезьян, что указывает на возможность формирования новых нейронов в обонятельной луковице приматов. Нейральные стволовые клетки выделены из обонятельной луковицы взрослого человека и переведены в линии, клонированные клетки которых дифференцируются в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Стволовые клетки обнаружены в гиппокампе зрелого мозга крыс, мышей, обезьян и человека. Нейральные стволовые клетки субгранулярной зоны зубчатой фасции являются источником клеток-предшественников, мигрирующих в медиальный и латеральный лимбы гиппокампа, где они дифференцируются в зрелые клетки-зерна и глиальные элементы. Аксоны сформированных de novo нейронов зубчатой фасции прослежены до поля САЗ, что указывает на участие новообразованных нейронов в реализации функций гиппокампа. В ассоциативных областях новой коры мозга взрослых обезьян обнаружены клетки-предшественники нейронов, мигрирующие из субвентрикулярной зоны. В VI слое новой коры головного мозга мышей новые пирамидные нейроны выявляются через 2-28 недель после индуцированного повреждения и гибели нативных нейронов этого слоя за счет миграции ранее дормантных клеток-предшественников субвентрикулярной зоны. Наконец, о реальности постнатального нейроногенеза в мозге человека свидетельствует двукратное увеличение числа корковых нейронов, продолжающееся в течение первых 6 лет после рождения.

Немаловажное значение для практической клеточной трансплантологии имеет вопрос о регуляции процессов размножения и дифференциации нейральных стволовых и прогениторных клеток. Наибольшее значение среди факторов, угнетающих пролиферацию нейральных клеток-предшественников, имеют глюкокортикоиды, которые резко уменьшают количество делений, тогда как удаление надпочечников, напротив, значительно увеличивает число митозов (Gould, 1996). Примечательно, что морфогенез зубчатой извилины у грызунов наиболее интенсивен на протяжении первых двух недель постнатального развития в период отсутствия реакции на стресс на фоне резкого снижения продукции и секреции стероидных гормонов коркового вещества надпочечников. Кортикостероиды тормозят миграцию клеток-зерен - новые нейроны не встраиваются в зернистый слой зубчатой извилины, а остаются в хилусе. Допускается, что одновременно нарушаются и процессы образования синаптических связей. Защита клеток от такой “стероидной агрессии” осуществляется путем минимальной экспрессии минерало- и глюкокортикоидных рецепторов на пролиферирующих клетках-зернах не только в ходе развития зубчатой извилины, но и у зрелых животных. Тем не менее, из всех нейронов головного мозга именно нейроны гиппокампа характеризуются наиболее высоким содержанием рецепторов глюкокортикоидов, что и обуславливает стрессовое воздействие на гиппокамп. Психоэмоциональное напряжение и стрессовые ситуации угнетают нейроногенез, а хронический стресс резко снижает способность животных к усвоению новых навыков и обучению. Более выраженное негативное влияние хронического стресса на нейроногенез вполне понятно, если учесть преимущественно дормантное состояние нейральных стволовых клеток. При иммобилизации беременных крыс (для грызунов - сверхсильный стрессовый фактор) установлено, что и пренатальный стресс также вызывает уменьшение числа клеток в зубчатой извилине и существенно угнетает нейроногенез. Известно, что глюкокортикоиды принимают участие в патогенезе депрессивных состояний, морфологическим эквивалентом которых является торможение нейроногенеза, патологическая перестройка нейронов и межнейронных связей, а также гибель нервных клеток. С другой стороны, средства антидепрессивной химиотерапии активируют образование нейронов de novo, что подтверждает связь между процессами образования новых нейронов в гиппокампе и развитием депрессии. Существенное влияние на нейроногенез оказывают эстрогены, эффекты которых противоположны действию глюкокортикостероидов и заключаются в поддержке пролиферации и жизнеспособности нейральных прогениторных клеток. Нужно заметить, что эстрогены значительно повышают способность животных к обучению. Некоторые авторы с влиянием эстрогенов связывают циклические изменения количества клеток-зерен и превышающее их число у самок.

Известно, что нейроногенез контролируется EGF, FGF и BDNF, однако механизмы воздействия внешних сигналов на стволовые клетки со стороны митогенов и факторов роста изучены недостаточно. Установлено, что PDGF in vitro поддерживает нейрональную направленность дифференцировки клеток-предшественников, а цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), как и трийодтиронин, стимулирует формирование преимущественно глиальных элементов - астроцитов и олигодендроцитов. Гипофизарный аденилатциклаз-активирующий белок (РАСАР) и вазоактивный интестинальный пептид (VIP) активируют пролиферацию нейральных клеток-предшественников, но при этом тормозят процессы дифференцировки дочерних клеток. Опиоиды, особенно в случае длительного их воздействия, значительно угнетают нейроногенез. Однако у стволовых клеток и нейральных прогениторных клеток-предшественников зубчатой извилины не выявлено опиоидных рецепторов (они имеются у дифференцирующихся нейронов эмбрионального периода), что не позволяет оценить прямые эффекты опиоидов.

Потребности практической регенеративно-пластической медицины заставили исследователей уделить особое внимание изучению плюри- и мультипотентности стволовых клеток. Реализация этих свойств на уровне регионарной стволовой клетки взрослого организма в перспективе могла бы обеспечить наработку необходимого трансплантационного материала. Выше было показано, что эпигенетическая стимуляция нейральных стволовых клеток позволяет получить пролиферирующие клетки, уже преформированные по нейральным фенотипам, что ограничивает их количество. В случае использования тотипотентных свойств эмбриональной стволовой клетки пролиферация до получения достаточного количества клеток происходит раньше нейральной дифференцировки, а размноженные клетки легко конвертируются в нейральный фенотип. Для получения нейральных стволовых клеток ЭСК выделяют из внутренней клеточной массы бластоцисты и культивируют при обязательном присутствии LIF, что сохраняет их тотипотентность и способность к неограниченному делению. После этого с помощью ретиноевой кислоты индуцируют нейральную дифференцировку ЭСК. Трансплантация полученных таким образом нейральных стволовых клеток в поврежденный квинолином и 6-гидроксидопамином стриатум сопровождается их дифференцировкой в дофаминергические и серотонинергические нейроны. После введения в желудочки головного мозга эмбриона крысы нейральные клетки-предшественники, полученные из ЭСК, мигрируют в различные области мозга реципиента, в том числе в кору, стриатум, септум, таламус, гипоталамус и мозжечок. Клетки, остающиеся в полости желудочков, формируют эпителиальные структуры, напоминающие нервную трубку, а также отдельные островки ненейральной ткани. В паренхиме мозга эмбриона-реципиента пересаженные клетки продуцируют три основных типа клеток нервной системы. Некоторые из них имеют вытянутые апикальные дендриты, тела пирамидных клеток и базальные аксоны, проецирующиеся в мозолистое тело. Астроциты донорского происхождения простирают отростки к близлежащим капиллярам, а олигодендроциты тесно контактируют с миелиновыми муфтами, принимая участие в образовании миелина. Таким образом, нейральные клетки-предшественники, полученные из ЭСК in vitro, способны к направленной миграции и адекватной сигналам микроокружения регионарной дифференцировке, обеспечивая многие области развивающегося мозга нейронами и глией.

Некоторыми авторами рассматривается возможность де- и трансдифференцировки регионарных стволовых клеток взрослого организма. Косвенным подтверждением дедифференцировки клеток в культуре с расширением их потенций служат данные о приживлении стволовых нейральных клеток мышей в красном костном мозге с последующим развитием из них клеточных линий, дающих функционально активные клетки периферической крови. Кроме того, трансплантация генетически меченых (LacZ) клеток нейросфер, полученных из зрелого или эмбрионального мозга, в головной мозг облученных мышей с угнетенным кроветворением приводила к образованию из стволовых клеток не только нейральных производных, но и вызывала генерацию клеток крови, что свидетельствует о плюрипотентности нейральных стволовых клеток, реализуемой за пределами головного мозга. Таким образом, нейральная стволовая клетка способна дифференцироваться в клетки крови под влиянием сигналов микроокружения костного мозга с предварительной трансформацией в кроветворную стволовую клетку. С другой стороны, при пересадке костномозговых стволовых кроветворных клеток в головной мозг установлена их дифференцировка под влиянием микроокружения ткани мозга в глиальные и нервные клетки. Следовательно, дифференци- ровочный потенциал нервных и кроветворных стволовых клеток не ограничен тканевой специфичностью. Другими словами, факторы локального микроокружения, отличные от характерных для тканей головного и костного мозга, способны изменить направленность дифференцировки этих клеток. Показано, что нейральные стволовые клетки, введенные в венозную систему облученных мышей, создают в селезенке и костном мозге популяции миелоидных, лимфоидных и незрелых гемопоэтических клеток. In vitro установлено влияние морфогенетических белков костного мозга (BMPs) на выживаемость и дифференцировку нейральных стволовых клеток, определяющее, как и на ранних этапах эмбриогенеза, их развитие в нейральном или глиальном направлениях. В культурах нейральных стволовых клеток 16-суточных эмбрионов крыс BMPs индуцируют образование нейронов и астроглии, тогда как в культурах стволовых клеток, полученных из перинатального мозга, формируются только астроциты. Кроме того, BMPs подавляют генерацию олигодендроцитов, которые in vitro появляются только при условии добавления антагониста BMPs ноггина.

Процессам трансдифференцировки присуща видонеспецифичность: гемопоэтические стволовые клетки костного мозга человека, пересаженные в стриатум половозрелых крыс, мигрируют в белое вещество наружной капсулы, ипси- и контралатеральный неокортекс, где образуют астроцитоподобные клеточные элементы (Azizi et al., 1998). При аллотрансплантации стволовых клеток костного мозга в боковой желудочек новорожденных мышей миграция гемопоэтических стволовых клеток прослеживается до структур переднего мозга и мозжечка. В стриатуме и молекулярном слое гиппокампа мигрировавшие клетки трансформируются в астроциты, а в обонятельной луковице, внутреннем слое клеток-зерен мозжечка и ретикулярной формации ствола мозга образуют нейроноподобные клетки с позитивной реакцией на нейрофиламенты. После внутривенного введения взрослым мышам гемопоэтических клеток GFP-меченые микро- и астроциты выявляются в неокортексе, таламусе, стволе мозга и мозжечке.

Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, дающие начало всем типам клеток соединительной ткани, в определенных условиях также могут претерпевать нейральную трансдифференцировку (напомним, что эмбриональным источником мезенхимы являются клетки нервного гребня). Показано, что стромальные клетки костного мозга человека и мыши, культивируемые in vitro в присутствии EGF или BDNF, экспрессируют маркер нейральных клеток-предшественников нестин, а добавление различных комбинаций факторов роста приводит к образованию клеток с маркерами глии (GFAP) и нейронов (ядерный белок, NeuN). Меченые сингенные мезенхимальные стволовые клетки, трансплантированные в латеральный желудочек мозга новорожденных мышей, мигрируют и локализуются в переднем мозге и мозжечке, не нарушая цито-архитектонику мозга реципиента. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга дифференцируются в зрелые астроциты в полосатом теле и молекулярном слое гиппокампа, а также заселяют обонятельную луковицу, гранулярные слои мозжечка и ретикулярную формацию, где превращаются в нейроны. Мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга человека способны in vitro дифференцироваться в макроглию, а после трансплантации интегрироваться в структуры головного мозга крыс. Прямая трансплантация мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в гиппокамп взрослых крыс также сопровождается их миграцией в паренхиму мозга и нейроглиальной дифференцировкой.

Допускается, что трансплантация стволовых клеток костного мозга может расширить возможности клеточной терапии заболеваний ЦНС, характеризующихся избыточной патологической гибелью нейронов. Надо, однако, заметить, что далеко не все исследователи признают факт взаимной трансформации нейральных и гемопоэтических стволовых клеток, особенно в условиях in vivo, что опять-таки обусловлено отсутствием надежного маркера для оценки их трансдифференцировки и дальнейшего развития.

Трансплантация стволовых клеток открывает новые горизонты для клеточной генной терапии наследственной неврологической патологии. Генетическая модификация нейральных стволовых клеток предусматривает встраивание генетических регуляторных конструкций, продукты которых взаимодействуют с белками клеточного цикла в режиме автоматической регуляции. Трансдукция таких генов в эмбриональные клетки-предшественники используется для размножения нейральных стволовых клеток. Большинство генетически модифицированных клеточных клонов ведет себя подобно стабильным клеточным линиям, не проявляя признаков трансформации in vivo или in vitro, но обладает выраженной способностью к контактному торможению пролиферации. При трансплантации размноженных трансфецированных клеток последние встраиваются в ткань реципиента, не нарушая цитоархитектонику и не подвергаясь опухолевой трансформации. Донорские нейральные стволовые клетки не деформируют зону интеграции и равноправно конкурируют за пространство с клетками-предшественниками хозяина. Однако на 2-3-е сутки интенсивность деления клеток-трансфектантов резко снижается, что соответствует контактному ингибированию их пролиферации in vitro. У эмбрионов-реципиентов нейральных стволовых трансфектантов отсутствуют аномалии развития ЦНС, все зоны головного мозга, контактирующие с трансплантатом, развиваются нормально. После трансплантации клоны нейральных стволовых клеток быстро мигрируют из зоны введения и нередко выходят за пределы соответствующих зародышевых зон по ростральному тракту, адекватно интегрируясь с иными зонами мозга. Встраивание генетически модифицированных клонов и трансфецированных клеточных линий нейральных стволовых клеток в головной мозг организма-хозяина характерно не только для эмбрионального периода: эти клетки имплантируются в многочисленные зоны ЦНС плода, новорожденного, взрослого и даже стареющего организма реципиента и проявляют при этом способность к адекватной интеграции и дифференцировке. В частности, после трансплантации в полость желудочков головного мозга трансфецированные клетки мигрируют, не повреждая гемато- энцефалический барьер, и становятся интегральными функциональными клеточными компонентами ткани мозга. Донорские нейроны образуют соответствующие синапсы и экспрессируют специфические ионные каналы. При сохранении целостности гематоэнцефалического барьера астроглия, производная нейральных стволовых клеток-трансфектантов, простирает отростки на церебральные сосуды, а олигодендроциты донорского происхождения экспрессируют основной белок миелина и миелинизируют отростки нейронов.

Кроме того, нейральные стволовые клетки трансфецируют для использования в качестве клеточных векторов. Такие векторно-генетические конструкции обеспечивают in vivo стабильную экспрессию чужеродных генов, участвующих в развитии нервной системы, или применяются с целью коррекции имеющихся генетических дефектов, поскольку продукты этих генов способны восполнять различные биохимические аномалии ЦНС. Высокая миграционная активность трансфецированных стволовых клеток и адекватная имплантация в зародышевые зоны различных областей развивающегося мозга позволяют надеяться на полное восстановление наследственного дефицита клеточных ферментов. При моделировании синдрома атаксии-телеангиэктазии (мутантные линии мышей пг и pcd) клетки Пуркинье исчезают из мозжечка экспериментальных животных в течение первых недель постнатального развития. Показано, что введение нейральных стволовых клеток в мозг таких животных сопровождается их дифференцировкой в клетки Пуркинье и гранулярные нейроны. У мутантов pcd частично корригируются нарушения координации движений и уменьшается интенсивность тремора. Подобные результаты получены при трансплантации клонированных нейральных стволовых клеток человека приматам, у которых дегенерацию клеток Пуркинье индуцировали с помощью онконазы. После трансплантации донорские нейральные стволовые клетки были обнаружены в гранулярном и молекулярном слоях, а также в слое клеток Пуркинье паренхимы мозжечка. Следовательно, генетическая модификация нейральных клеток-предшественников способна обеспечить стабильную коммитированную модификацию фенотипа, устойчивую к внешним воздействиям. Это особенно важно при патологических процессах, сопряженных с выработкой у реципиента факторов, препятствующих выживанию и дифференцировке донорских клеток (например, при иммунной агрессии).

Мукополисахаридоз типа VII у человека характеризуется нейродегенерацией и прогрессирующей задержкой интеллектуального развития, что в эксперименте на мышах моделируется делеционной мутацией гена бета-глюкуронидазы. После трансплантации в желудочки мозга новорожденных дефектных мышей-реципиентов трансфецированных нейральных стволовых клеток, секретирующих бета-глюкуронидазу, донорские клетки обнаруживаются сначала в терминальной зоне, а затем распространяются по паренхиме головного мозга, стабильно корригируя целостность лизосом в мозге мышей-мутантов. В модели болезни Тея-Сакса трансдуцированные ретровирусом нейральные стволовые клетки при внутриутробном введении в плод мыши и трансплантации новорожденным мышам обеспечивают эффективную экспрессию бета-субъединицы бета-гексозаминидазы у реципиентов с мутацией, приводящей к патологическому накоплению бета2-ганглиозида.

Еще одним направлением регенерационной медицины является стимуляция пролиферативного и дифференцировочного потенциала собственных нейральных стволовых клеток больного организма. В частности, нейральные стволовые клетки секретируют NT-3 при гемисекции спинного мозга и асфиксии головного мозга у крыс, экспрессируют NGF и BDNF в септуме и базальных ганглиях, тирозингидроксилаз - в стриатуме, а также рилин - в мозжечке и основной белок миелина - в головном мозге.

Однако вопросам стимуляции нейроногенеза уделяется явно недостаточно внимания. Немногочисленные работы дают основание полагать, что функциональная нагрузка на нервные центры, ответственные за различение запахов, отражается на образовании новых нейронов. У трансгенных мышей с дефицитом нейрональных молекул адгезии снижение интенсивности нейроногенеза и уменьшение числа мигрирующих в обонятельные луковицы нейронов сочеталось с нарушением способности различать запахи, хотя порог восприятия запаха и кратковременная обонятельная память при этом не нарушались. В регуляции нейроногенеза большую роль играет функциональное состояние клеток зубчатой извилины: ослабление эффекта воздействия глутамата на клетки-зерна после разрушения энторинальной коры способствует пролиферации и дифференцировке нейронов, а стимуляция волокон перфорантного пути (основного афферентного входа в гиппокамп) вызывает торможение нейроногенеза. Антагонисты NMDA-рецепторов активируют процессы новообразования нейронов, тогда как агонисты, наоборот, снижают интенсивность нейроногенеза, что по эффекту напоминает действие глюкокортикостероидов. В литературе встречаются противоречивые результаты исследований: сведения об экспериментально доказанном угнетающем воздействии возбуждающего нейромедиатора глутамата на нейроногенез не согласуются с данными о стимуляции размножения клеток-предшественников и появлении новых нейронов при повышении судорожной активности в гиппокампе животных с экспериментальными каиновой и пилокарпиновой моделями эпилепсии. В то же время на традиционной модели эпилепсии, вызванной многократным субпороговым раздражением определенной области мозга (киндлинг) и характеризующейся менее выраженной гибелью нейронов, интенсивность нейроногенеза возрастает только в поздней фазе киндлинга, когда в гиппокампе отмечается повреждение и гибель нейронов. Показано, что при эпилепсии судорожная активность стимулирует нейроногенез с аномальной локализацией новых зернистых нейронов, многие из которых появляются не только в зубчатой извилине, но и в хилусе. Такие нейроны имеют большое значение в развитии спраутинга моховидных волокон, поскольку их аксоны образуют отсутствующие в норме обратные коллатерали, формирующие многочисленные синапсы с соседними клетками-зернами.

Использование регионарных нейральных стволовых клеток открывает новые перспективы применения клеточной трансплантации в терапии метаболических и генетических нейродегенеративных заболеваний, демиелинизирующих болезней и посттравматических нарушений функций ЦНС. Перед выполнением заместительной клеточной трансплантации по одному из методов проводится селекция и экспансия необходимого типа нейральных клеток-предшественников ex vivo с целью их последующего введения непосредственно в поврежденный участок мозга. Терапевтический эффект в данном случае обусловлен замещением поврежденных клеток или же локальным высвобождением факторов роста и цитокинов. Этот способ регенеративно-пластической терапии требует трансплантации достаточно большого количества клеток с предварительно заданными функ-циональными характеристиками.

Целесообразными следует признать и дальнейшие исследования по изучению молекулярных характеристик и регенеративно-пластических потенций стволовых клеток зрелого мозга, a также способности к трансдифференцировке регионарных стволовых клеток разного тканевого происхождения. Сегодня уже проведен скрининг антигенов кроветворных стволовых клеток костного мозга с определением маркерной комбинации клеток, способных трансдифференцироваться в нейральные стволовые клетки-предшественники (CD 133+, 5Е12+, CD34-, CD45-, CD24 ). Получены клетки, образующие in vitro нейросферы и формирующие нейроны при трансплантации в головной мозг новорожденных иммунодефицитных мышей. Интерес для клеточной ксенотрансплантологии представляют результаты исследований о возможности перекрестной трансплантации стволовых клеток у особей эволюционно отдаленных таксонов. Пока остаются без надлежащей интерпретации результаты имплантации нейральных стволовых клеток в область опухоли головного мозга: пересаженные клетки активно мигрируют по всему объему опухоли, не выходя за ее пределы, а при введении клеток в интактную часть мозга наблюдается их активная миграция в сторону опухоли. Вопрос о биологической значимости такой миграции остается открытым.

Необходимо отметить, что успешная трансплантация нейральных стволовых клеток, как и других нейральных клеток-предшественников, полученных из ЭСК, возможна только в условиях использования высокоочищенных нейральных прогениторных клеток, поскольку недифференцированные эмбриональные стволовые клетки при трансплантации взрослому иммунокомпетентному реципиенту неизбежно трансформируются в тератомы и тератокарциномы. Даже минимальное количество низкодифференцированных клеток в донорской клеточной суспензии резко повышает туморогенность трансплантата и недопустимо увеличивает риск возникновения опухолей или образования ненейральной ткани. Получение гомогенных популяций нейральных клеток-предшественников возможно при использовании в качестве альтернативного источника донорской ткани клеток, возникающих на определенных этапах нормально протекающего эмбриогенеза. Другой подход заключается в тщательной элиминации нежелательных клеточных популяций путем линиеспецифической селекции. Опасность также представляет применение с целью нейротрансплантации ЭСК после их недостаточной экспозиции in vitro с факторами роста. В этом случае не исключен сбой программы нейральной дифференцировки с формированием структур, присущих нервной трубке.

Сегодня совершенно очевидно, что нейральные стволовые клетки проявляют тропизм к патологически измененным областям ЦНС и обладают выраженным регенеративно-пластическим эффектом. Микроокружение в очаге гибели клеток нервной ткани моделирует направленность дифференцировки трансплантированных клеток, восполняя, таким образом, дефицит специфических нейральных элементов в пределах зоны поражения ЦНС. При некоторых нейродегенеративных процессах возникают нейрогенные сигналы к рекапитуляции нейроногенеза, и нейральные стволовые клетки зрелого мозга способны отвечать на эту инструктирующую информацию. Наглядной иллюстрацией терапевтических возможностей нейральных стволовых клеток служат многочисленные данные экспериментальных исследований. Интрацистернальное введение клона нейральных стволовых клеток животным с перевязкой средней церебральной артерии (модель ишемического инсульта) способствует уменьшению площади и объема деструктивно измененного участка мозга, особенно в случае пересадки нейральных стволовых клеток вместе с FGF2. Иммуноцитохимически при этом наблюдается миграция донорских клеток в зону ишемии с последующей их интеграцией с интактными клетками мозга реципиента. Трансплантация незрелых клеток нейроэпителиальной линии МНР36 мыши в головной мозг крыс при экспериментальном инсульте улучшает сенсомоторную функцию, а введение этих клеток в желудочки мозга усиливает познавательную функцию. В результате трансплантации крысам нейрально-преформированных гемопоэтических клеток костного мозга человека устраняются нарушения функции коры головного мозга, вызванные ишемическим повреждением. При этом ксеногенные нейральные прогениторные клетки мигрируют из места введения в зону деструктивных изменений ткани мозга. Интракраниальная пересадка гомологичных костномозговых клеток при травматическом повреждении коры головного мозга у крыс приводит к частичному восстановлению моторной функции. Клетки донора приживляются, пролиферируют, претерпевают нейральную дифференцировку в нейроны и астроциты и мигрируют в направлении очага поражения. При введении в стриатум взрослых крыс с экспериментальным инсультом клонированные нейральные стволовые клетки человека замещают поврежденные клетки ЦНС и частично восстанавливают нарушенные функции головного мозга.

Нейральные стволовые клетки человека преимущественно выделяют из эмбрионального телэнцефалона, который развивается значительно позже, чем более каудально расположенные участки нервного ствола. Показана возможность выделения нейральных стволовых клеток из спинного мозга 43-137-суточного плода человека, поскольку в присутствии EGF и FGF2 эти клетки формируют нейросферы и на ранних пассажах проявляют мультипотентность, дифференцируясь в нейроны и астроциты. Однако длительное культивирование нейральных клеток-предшественников (свыше 1 года) лишает их мультипотентности - такие клетки способны дифференцироваться только в астроциты, то есть, они становятся унипотентными. Регионарные нейральные стволовые клетки могут быть получены в результате частичной бульбэктомии и после размножения в культуре в присутствии LIF трансплантироваться тому же самому больному с нейродегенеративными изменениями в других отделах ЦНС. В клинике заместительная клеточная терапия с использованием нейральных стволовых клеток впервые была проведена для лечения больных с инсультом, сопровождающимся поражением базальных ганглиев головного мозга. В результате трансплантации донорских клеток отмечено улучшение клинического состояния большинства больных.

Некоторые авторы считают, что способность нейральных стволовых клеток приживляться, мигрировать и интегрироваться в различные области нервной ткани при повреждении ЦНС открывает неограниченные возможности для клеточной терапии не только локальных, но и обширных (инсульт или асфиксия), мультиочаговых (рассеянный склероз) и даже глобальных (большинство наследуемых метаболических нарушений или нейродегенеративные деменции) патологических процессов. Действительно, при пересадке клонированных нейральных стволовых клеток мыши и человека животным-реципиентам (мышам и приматам соответственно) с дегенерацией дофаминергических нейронов в мезостриальной системе, индуцированной введением метил-фенил-тетрапиридина (модель болезни Паркинсона) за 8 месяцев до трансплантации, донорские нейральные стволовые клетки интегрируются в ЦНС реципиента. Спустя месяц трансплантированные клетки локализуются билатерально вдоль среднего мозга. Часть образовавшихся нейронов донорского происхождения экспрессирует тирозингидролазу при отсутствии признаков иммунной реакции на трансплантат. У крыс, которым вводили 6-гидроксидопамин (еще одна экспериментальная модель болезни Паркинсона), адаптация трансплантированных клеток к микроокружению в мозге хозяина определялась условиями культивирования нейральных стволовых клеток до их пересадки. Нейральные стволовые клетки, быстро пролиферирующие in vitro под воздействием EGF, восполняли дефицит дофаминергических нейронов в поврежденном стриатуме более эффективно, чем клетки из 28-суточных культур. Авторы считают, что это связано с утратой способности к восприятию соответствующих дифференцировочных сигналов в процессе клеточного деления нейральных клеток-предшественников in vitro.

В отдельных работах предпринимались попытки повысить эффективность воздействия на процессы реиннервации поврежденного стриатума путем пересадки в эту область клеток эмбрионального стриатума в качестве источника нейротрофических факторов с одновременной трансплантацией дофаминергических нейронов вентрального мезэнцефалона. Как выяснилось, эффективность нейротрансплантации во многом зависит от способа введения эмбриональной нервной ткани. В результате исследований по пересадке препаратов эмбриональной нервной ткани в желудочковую систему мозга (во избежание травмы паренхимы стриатума) получены сведения о положительном их влиянии на моторный дефект при паркинсонизме.

Однако в других исследованиях экспериментальные наблюдения показали, что трансплантация в желудочек мозга препаратов эмбриональной нервной ткани вентрального мезэнцефалона, содержащих дофаминергические нейроны, как и пересадка ГАМК-ергических эмбриональных нейральных элементов в стриатум крыс с гемипаркинсонизмом, не способствует восстановлению нарушенных функций дофаминергической системы. Напротив, иммуноцитохимический анализ подтвердил данные о низкой выживаемости дофаминергических нейронов вентрального мезэнцефалона, пересаженных в стриатум крыс. Терапевтический эффект внутрижелудочковой трансплантации эмбриональной нервной ткани вентрального мезэнцефалона реализовался только при условии одновременной имплантации в денервированный стриатум препарата эмбриональных стриарных клеток. Авторы полагают, что механизм этого эффекта связан с позитивным трофическим влиянием ГАМК-ергических элементов эмбрионального стриатума на специфическую дофаминергическую активность внутрижелудочковых трансплантатов вентрального мезэнцефалона. Выраженная глиальная реакция в трансплантатах сопровождалась незначительным регрессом показателей апоморфинового теста. Последние, в свою очередь, коррелировали с содержанием GFAP в сыворотке крови, что прямо указывало на нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера. На основании этих данных, авторы пришли к заключению, что уровень GFAP в сыворотке крови может быть использован как адекватный критерий оценки функционального состояния трансплантата, а повышенная проницаемость гематоэнцефалического барьера для нейроспецифических антигенов типа GFAP является патогенетическим звеном в развитии несостоятельности трансплантатов вследствие аутоиммунного повреждения нервной ткани реципиента.

С точки зрения других исследователей, приживление и интеграция нейральных стволовых клеток после трансплантации стабильны и пожизненны, поскольку донорские клетки обнаруживаются у реципиентов на протяжении не менее двух лет после пересадки и без существенного уменьшения их количества. Попытки объяснить это тем, что в недифференцированном состоянии нейральные стволовые клетки не экспрессируют молекулы МНС классов I и II на уровне, достаточном для индукции реакции иммунного отторжения, можно признать справедливыми только по отношению к низкодифференцированным нейральным предшественникам. Однако не все нейральные стволовые клетки в мозге реципиента сохраняются в незрелодормантном состоянии. Большая их часть подвергается дифференцировке, в процессе которой молекулы МНС экспрессируются в полном объеме.

В частности, недостаточная эффективность использования с целью лечения экспериментального паркинсонизма интрастриарной трансплантации препаратов эмбрионального вентрального мезэнцефалона, содержащих дофаминергические нейроны, связывается с низкой выживаемостью пересаженных дофаминер- гических нейронов (всего 5-20%), что обусловлено реактивным глиозом, сопровождающим локальную травму паренхимы мозга при трансплантации. Известно, что локальная травма паренхимы мозга и сопутствующий глиоз приводят к нарушению целостности гематоэнцефалического барьера с выходом в периферическую кровь антигенов нервной ткани, в частности ОКАР и нейронспецифического антигена. Наличие в крови этих антигенов может вызвать выработку специфических цитотоксических антител к ним и развитие аутоиммунной агрессии.

В. Цымбалюк и соавторы (2001) сообщают о том, что пока еще в силе остается традиционная точка зрения, согласно которой ЦНС является иммунологически привилегированной зоной, изолированной от иммунной системы гематоэнцефалическим барьером. В своем обзоре литературы авторы ссылаются на целый ряд работ, свидетельствующих о том, что эта точка зрения не вполне соответствует сущности иммунных процессов в мозге млекопитающих. Установлено, что меченые вещества, введенные в паренхиму мозга, могут достигать глубоких шейных лимфатических узлов, а после внутрицеребральной инъекции антигенов в организме образуются специфические антитела. Клетки шейных лимфатических узлов отвечают пролиферацией на такие антигены, начиная с 5-го дня после инъекции. Выявлено формирование специфических антител и при трансплантации кожи в паренхиму мозга. Авторы обзора приводят несколько предположительных путей транспорта антигена из мозга в лимфатическую систему. Один из них - переход антигенов из периваскулярных пространств в субарахноидальное пространство. Допускается, что периваскулярные пространства, локализованные вдоль крупных сосудов головного мозга, являются эквивалентом лимфатической системы в мозге. Второй путь лежит вдоль белых волокон - через решетчатую кость в лимфатические сосуды слизистой оболочки носа. Кроме того, существует обширная сеть лимфатических сосудов и в твердой мозговой оболочке. Весьма относительна и непроницаемость гематоэнцефалического барьера для лимфоцитов. Доказано, что активированные лимфоциты способны продуцировать энзимы, влияющие на проницаемость структур “иммунного фильтра” мозга. На уровне посткапиллярных венул активированные Т-хелперы проникают и через интактный гематоэнцефалический барьер. Не выдерживает критики тезис об отсутствии в мозге клеток, репрезентирующих антиген. В настоящее время убедительно доказана возможность представления антигенов в ЦНС по крайней мере тремя видами клеток. Во-первых, это дендритные клетки костномозгового происхождения, которые локализуются в головном мозге вдоль крупных кровеносных сосудов и в белом веществе. Во-вторых, антигены способны презентировать эндотелиальные клетки кровеносных сосудов мозга, причем в ассоциации с антигенами МНС, что поддерживает клональный рост специфических к этим антигенам Т-клеток. В-третьих, в качестве антигенпредставляющих агентов выступают клетки микро- и астроглии. Участвуя в формировании иммунного ответа в ЦНС, астроциты приобретают свойства иммунноэффекторной клетки и экспрессируют ряд антигенов, цитокинов и иммуномодуляторов. При инкубации с у-интерфероном (y-INF) астроглиальные клетки in vitro экспрессируют антигены МНС классов I и II, а стимулированные астроциты способны к антигенной репрезентации и поддержанию клональной пролиферации лимфоцитов.

Травматизация ткани мозга, послеоперационное воспаление, отек и отложения фибрина, сопровождающие трансплантацию эмбриональной нервной ткани, создают условия для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера с нарушением аутотолерантности, сенсибилизацией и активацией СDЗ+СD4+-лимфоцитов. Презентацию ауто- и аллоантигенов осуществляют астроциты и микроглиальные клетки, реагирующие на y-INF экспрессией молекул МНС, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, костимулирующих молекул В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86), а также секрецией IL-la, IL-ip и y-INF.

Следовательно, факт более длительного выживания эмбриональной нервной ткани при интрацеребральной трансплантации, нежели при ее периферическом введении, вряд ли можно связать с отсутствием инициации трансплантационного иммунитета. Тем более, что моноциты, активированные лимфоциты (цитотоксические CD3+CD8+ и Т-клетки-хелперы) и цитокины, которые они продуцируют, а также антитела к антигенам периферического трансплантата эмбриональной нервной ткани играют главную роль в процессе его отторжения. Определенное значение в создании условий для более длительной устойчивости нейротрансплантатов к Т-клеточным иммунным процессам имеет невысокий уровень экспрессии молекул МНС в эмбриональной нервной ткани. Именно поэтому в эксперименте иммунное воспаление после трансплантации эмбриональной нервной ткани в мозг развивается более медленно, чем после пересадки кожи. Тем не менее, через 6 месяцев наблюдается полная деструкция отдельных трансплантатов нервной ткани. При этом в зоне трансплантации локализуются преимущественно Т-лимфоциты, рестриктированные по антигенам МНС класса II (Nicholas et al., 1988). Экспериментально установлено, что при ксенологической нейротрансплантации истощение уровня Т-хелперов (L3T4+), но не цитотоксических Т-лимфоцитов (Lyt-2), продлевает выживание нервной ткани крыс в мозге мышей-реципиентов. Отторжение нейротрансплантата сопровождается его инфильтрацией макрофагами и Т-лимфоцитами хозяина. Следовательно, макрофаги и активированные клетки микроглии хозяина действуют in situ как антигенпрезентирующие иммуностимулирующие клетки, а повышение экспрессии донорских антигенов МНС класса I усиливает киллерную активность цитотоксических Т-лимфоцитов реципиента.

Не имеет смысла анализировать многочисленные спекулятивные попытки объяснить факт отторжения нейротрансплантата реакцией иммунной системы организма реципиента на эндотелиоциты или глиальные элементы донора, поскольку и чистые линии нейральных клеток-предшественников подвергаются иммунной атаке. Заслуживает внимания сообщение о том, что в механизмах более длительного выживания трансплантата в пределах ЦНС важную роль играет экспрессия клетками мозга Fas-лигандов, связывающих рецепторы апоптоза (Fas-молекулы) на Т-лимфоцитах, инфильтрирующих мозг, и индуцирующих их апоптоз, что является типичным защитным механизмом забарьерных аутоиммуногенных тканей.

Как справедливо отмечают В. Цымбалюк и соавторы (2001), трансплантация эмбриональной нервной ткани характеризуется развитием воспаления при участии сенсибилизированных к антигенам мозга и активированных клеток, антител, а также вследствие локальной продукции цитокинов. Немаловажную роль при этом играет предсуществующая сенсибилизация организма к антигенам мозга, которая возникает в период развития заболеваний ЦНС и может быть направлена на антигены трансплантата. Именно поэтому реально продолжительное выживание гистонесовместимых нейротрансплантатов достигается только путем супрессии системы иммунитета с помощью циклоспорина А или введения моноклональных антител к СD4+-лимфоцитам реципиента.

Таким образом, остается нерешенным множество проблем нейротрансплантации, в том числе и связанных с иммунологической совместимостью тканей, разрешить которые можно только после целенаправленных фундаментальных и клинических исследований.