Роль отложения кристаллов в патогенезе остеоартроза

У 30-60% больных с остеоартрозом обнаруживают кристаллы основного фосфата кальция (ОФК) в суставной жидкости. По мнению A. Swan и соавторов (1994), кальцийсодержащие кристаллы находятся в суставной жидкости у гораздо большего количества больных с остеоартрозом, однако из-за чрезмерно мелких размеров кристаллов или их малого количества они не идентифицируются с помощью общепринятых методик. Наличие кристаллов основного фосфата кальция в суставной жидкости коррелирует с рентгенологическими признаками дегенерации суставного хряща и ассоциируется с большим объемом выпота по сравнению с выпотом в коленных суставах без кристаллов. Изучение факторов, влияющих на рентгенологическое прогрессирование гонартроза, показало, что отложение кристаллов пирофосфата кальция дигидрата (ПФКД) является предиктором неблагоприятного клинического и рентгенологического исхода. При исследовании пациентов пожилого возраста обнаружили, что остеоартроз ассоциируется с хондрокальцинозом, особенно в латеральном тибиофеморальном отделе коленного сустава и в первых трех пястно-фаланговых суставах. Нередко у больных с остеоартрозом обнаруживают оба типа кристаллов - ОФК и ПФКД.

Клинически дегенерация суставного хряща, обусловленная отложением кальцийсодержащих кристаллов, отличается от таковой при первичном остеоартрозе. Если бы кристаллы были простым эпифеноменом дегенерации хряща, их обнаруживали бы в суставах, которые чаще всего поражаются первичным остеоартрозом, т.е. в коленных, тазобедренных, мелких суставах кистей. Напротив, болезни отложения кристаллов чаще поражают нетипичные для первичного остеоартроза суставы - плечевые, лучезапястные, локтевые. Наличие кристаллов в суставной (выпотной) жидкости ассоциируется с более тяжелой дегенерацией суставного хряща. Обсуждается вопрос о том, что является причиной, а что следствием - отложение кристаллов или дегенерация хряща. Промежуточную позицию занимает следующее предположение: первичная аномалия метаболизма хряща ведет к его дегенерации, а вторичное отложение кристаллов ускоряет его деградацию (так называемая теория амплификационной петли).

Точный механизм повреждения суставного хряша кальцийсодержащими кристаллами не известен, его отдельные элементы приведены ниже. Теоретически кальцийсодержащие кристаллы могут непосредственно повреждать хондроциты. Однако при гистологическом исследовании кристаллы редко локализуются вблизи хондроцитов, еще реже поглощаются ними. Наиболее вероятным является фагоцитоз кристаллов клетками синовиальной выстилки с последующим выделением ими протеолитических ферментов или секрецией цитокинов, стимулирующих выделение ферментов хондроцитами. Эта концепция подтверждается исследованием роли ПФКД-индуцированного синовита в развитии быстро прогрессирующего остеоартроза при пирофосфатной артропатии. В ходе этого исследования кроликам с остеоартрозом, индуцированным частичной латеральной менискэктомией, в правый коленный сустав вводили кристаллы пирофосфата кальция дигидрата (1 или 10 мг) 1 раз в неделю. Оказалось, что после 8 инъекций в правом коленном суставе были значительно более серьезные изменения по сравнению с левым. Интенсивность синовиального воспаления коррелировала с внутрисуставными инъекциями кристаллов пирофосфата кальция дигидрата и их дозой. Несмотря на то, что использованные в данном исследовании дозы кристаллов ПФКД превышают таковые in vivo, результаты свидетельствуют о роли ПФКД-индуцированного воспаления в прогрессировании остеоартроза при пирофосфатной артропатии.

Потенциальные механизмы индуцирования кальцийсодержащими кристаллами повреждения суставного хряща связаны с их митогенными свойствами, способностью индуцировать ММП и стимулировать синтез простагландинов.

Митогенный эффект кальцийсодержащих кристаллов. При кристаллас-социированных артропатиях часто обнаруживают пролиферацию клеток синовиальной выстилки, причем сами кристаллы лишь частично ответственны за этот процесс. Увеличение количества синовиальных клеток сопровождается усилением секреции цитокинов, которые способствуют хондролизу и вызывают секрецию протеолитических ферментов. Кристаллы ОФК в концентрациях, обнаруживаемых при патологии суставов у человека, дозозависимо стимулируют митогенез культуры покоящихся фибробластов кожи, синовиальных фибробластов собак и мышей. Кристаллы пирофосфата кальция дигидрата, урата, сульфата, карбоната и ли фосфата кальция стимулируют рост клеток. Начало и пик включения (³Н)-тимидина, индуцируемые этими кристаллами, смещены на 3 ч по сравнению со стимуляцией клеток сывороткой крови. Возможно, этот отрезок времени необходим для фагоцитоза и растворения кристаллов. Добавление контрольных кристаллов того же размера (например, бриллиантовой пыли или частичек латекса) не стимулировало митогенез. Кристаллы урата натрия моногидрата обладали слабыми митогенными свойствами и значительно уступали таковым урата кальция, что свидетельствует о важном значении в митогенезе содержания кальция в кристаллах. Синтетические кристаллы ОФК обладали такими же митогенными свойствами, как и кристаллы, полученные от пациентов с хондрокальцинозом. Митогенный эффект кальцийсодержащих кристаллов не был результатом повышения содержания кальция в окружающей клетку питательной среде in vitro, так как при растворении кристаллов основного фосфата кальция в питательной среде не стимулировало включение (³Н)-тимидина фибробластами.

Одним из предполагаемых механизмов ОФК-индуцированного мито-генеза является следующий: аномальная пролиферация синовиальных клеток может быть связана (по крайней мере частично) с эндоцитозом и внутриклеточным растворением кристаллов, что приводит к повышению концентрации Са²⁺ в цитоплазме клеток и к активации кальцийзависимого пути, ведущего к митогенезу. В поддержку этой концепции выступает необходимость прямого контакта клетка - кристалл для стимуляции митогенеза, так как экспозиция культуры клеток кристаллам вызывала рост клеток, а экспозиция клеток, лишенных возможности такого контакта, не вызвала их роста. Для изучения необходимости фагоцитоза кристаллов, следующего за взаимодействием клетка - кристалл, клетки культивировали с ⁴⁵Са-ОФК и (³Н)-тимидином. Оказалось, что содержащие ⁴⁵Са-ОФК клетки включали гораздо большее количество (³Н)-тимидина, чем клетки без меченых основным фосфатом кальция. В культуре макрофагов угнетение цитохалазином эндоцитоза кристаллов вызывало ингибицию растворения кристаллов, что также подчеркивает необходимость фагоцитоза.

Кальцийсодержащие кристаллы растворимы в кислоте. После фагоцитоза кристаллы растворяются в кислой среде фаголизосом макрофагов. Хлорохин, аммония хлорид, бафиломицин А1 и все лизосомотрофные агенты, повышающие лизосомальный рН, дозозависимо угнетают внутриклеточное растворение кристаллов и поглощение (³Н)-тимидина в фибро-бластах, культивируемых с кристаллами основного фосфата кальция.

Добавление ОФК-кристаллов к монослойной культуре фибробластов вызвало немедленное десятикратное повышение содержания внутриклеточного кальция, которое вернулось к исходному уровню через 8 мин. Источником кальция преимущественно был внеклеточный ион, так как кристаллы основного фосфата кальция были добавлены в бескальциевую питательную среду. Следующее повышение концентрации внутриклеточного кальция наблюдалось через 60 мин и продолжалось не менее 3 ч. Здесь источником кальция были фагоцитированные кристаллы, растворенные в фаголизосомах.

Установлено, что митогенный эффект ОФК-кристаллов похож на таковой у ФРПТ в качестве фактора роста; подобно последнему, ОФК-кристаллы проявляют синергизм по отношению к ИФР-1 и плазме крови. Блокада ИФР-1 снижает митогенез клеток в ответ на ОФК. P.G. Mitchell и соавторы (1989) показали, что индукция ОФК-кристаллами митогенеза фибробластов Balb/c-₃T₃ требует наличия сериновой/треониновой протеинкиназы С (ПКС) - одного из главных медиаторов сигналов, генерированных при внешней стимуляции клеток гормонами, нейротрансмиттерами и факторами роста. Снижение активности ПКС в клетках Balb/c-₃T₃ угнетает ОФК-опосредованную индукцию протоонкогенов c-fos и с-тус, но не влияет на стимуляцию этих онкогенов, опосредованную ФРПТ.

Повышение содержания внутриклеточного кальция после растворения фагоцитированных кристаллов - не единственный сигнальный путь для митогенеза. Когда факторы роста, такие, как ФРПТ, связываются со своим мембранным рецептором, стимулируется фосфолипаза С (фосфо-диэстераза), которая гидролизируетфосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат с образованием внутриклеточных мессенджеров - инозитол-3-фосфата идиацилглицерола. Первый высвобождает кальций из эндоплазматической сети, модулируя активность кальцийзависимых и кальций/кальмодулинзависимых ферментов, таких, как протеинкиназы и протеазы.

R. Rothenberg и Н. Cheung (1988) сообщили о повышенной деградации фосфолипазой С фосфатидилинозитола 4,5-бифосфата в синовиальных клетках кроликов в ответ на стимуляцию ОФК-кристаллами. Последние значительно повышают содержание инозитол-1-фосфата в клетках с меченым (³Н)-инозитолом; пик достигался в течение 1 мин и сохранялся около 1 ч.

Диацил-глицерол - потенциальный активатор пирофосфата кальция дигидрата. Так как ОФК-кристатлы повышают активность фосфолипазы С, что ведет к аккумуляции диацилглицерола, следовательно, можно ожидать повышения активации ПКС. P.G. Mitchell и соавторы (1989) сравнивали влияние ОФК-кристаллов и ФРПТ на синтез ДНК фибробластами Balb/c-₃T₃. В культуре клеток ПКС была инактивирована инкубацией клеток с туморподцерживающим форболовым диэфиром (ТФД), аналогом диацилглицерола. Длительная стимуляция низкими дозами ТФД снижает активность ПКС, тогда как однократная стимуляция высокой дозой - активирует. Стимуляция ОФК-кристаллами синтеза ДНК была угнетена после инактивации ПКС, что свидетельствует о важности этого фермента в ОФК-индуцированном митогенезе. Ранее G.M. McCarthy и соавторы (1987) продемонстрировали связь митогенного ответа фибробластов человека на ОФК-кристаллы с активацией ПКС. Однако ОФК-кристаллы не активируют фосфатидилинозитол-3-киназу или тирозинкиназы, подтверждая тот факт, что механизм активации клеток кристаллами ОФК селективен.

Пролиферацию клеток контролирует группа генов, называемых протоонкогенами. Белки foe и туе, продукты протоонкогенов c-fos и с-шус локализованы в клеточном ядре и связаны со специфическими последовательностями ДНК. Стимуляция ЗТЗ-фибробластов ОФК-кристаллами приводит к экспрессии c-fos в течение нескольких минут, которая достигает максимума через 30 мин после стимуляции. Индукция транскрипции с-mус ОФК-кристаллами или ФРПТ происходит в течение 1 ч и достигает максимума через 3 ч после стимуляции. Не менее 5 ч клетки поддерживают повышенный уровень транскрипции c-fos и c-myc. В клетках с инактивированной ПКС стимуляция c-fos и с-mус кристаллами ОФК или ТФД значительно угнетена, в то время как индукция этих генов ФРПТ не изменяется.

Представители семейства митогенактивированных протеинкиназ (МАП К) - ключевые регуляторы различных внутриклеточных сигнальных каскадов. Один из подклассов данного семейства - р42/р44 - регулирует пролиферацию клеток с помощью механизма, включающего активацию протоонкогенов c-fos и c-jun. ОФК- и ПФКД-кристаллы активируют протеинкиназный путь передачи сигнала, в котором участвуют оба р42 и р44, что свидетельствует о роли этого пути в митогенезе, индуцированном кальций-содержащими кристаллами.

Наконец, в ОФК-индуцированном митогенезе участвует транскрипционный ядерный фактор кВ (NF-kB), который впервые был описан как ген легкой цепи иммуноглобулина к (IgK). Это индуцированный транскрипционный фактор, важный для многих сигнальных путей, поскольку он регулирует экспрессию различных генов. Индукция NF-kB обычно сопряжена с высвобождением из цитоплазмы ингибиторных белков, называемых 1кВ. Вслед за индуцией NF-kB происходит транслокация активного транскрипционного фактора в ядро. Кристаллы ОФК индуцируют NF-kB в Balb/c-₃T₃ фибробластах и фибробластах кожи человека.

Несколько путей могут быть вовлечены в передачу сигнала после активации NF-кВ, однако все они включают протеинкиназы, которые фосфорилируют (и таким образом деградируют) 1кВ. Основываясь на результатах исследований in vitro, ранее предполагали, что 1кВ служит субстратом для киназ (например, ПКС и протеинкиназа А). Однако недавно был идентифицирован 1кВ-киназный комплекс большой молекулярной массы. Эти киназы специфически фосфорилируют сериновые остатки 1кВ. Активация NF-кВ ФНО-а и ИЛ-1 требует эффективного действия NF-кВ-индуцирующей киназы (НИК) и 1кВ-киназы. Молекулярный механизм активации НИК в настоящее время не известен. Несмотря на то, что кристаллы ОФК активируют и ПКС и NF-кВ, неизвестно, в какой степени эти два процесса могут быть связаны. Так как модификация ГкВ-киназы осуществляется путем фосфорилирования, не исключается роль ПКС в индукции кристаллами ОФК NF-кВ путем фосфорилирования и активации ГкВ-киназы. В поддержку этой концепции может служить угнетение ингибитором ПКС стауроспорином ОФК-кристаллиндуцированного митогенеза и экспрессии NF-кВ. Аналогично стауроспорин может угнетать ГкВ-киназу, а значит, угнетает протеинкиназуА и другие протеинкиназы.

Таким образом, механизм ОФК-кристаллиндуцированного митогенеза в фибробластах включает не менее двух различных процессов:

• быстрое мембранно-связанное событие, которое приводит к активации ПКС и МАП К, индукции NF-кВ и протоонкогенов,
• более медленное внутриклеточное растворение кристаллов, что ведет к повышению внутриклеточного содержания Са²⁺, а затем к активации ряда кальцийзависимых процессов, стимулирующих митогенез.

[1], [2], [3]