Один флакон, две мишени: портативный CRISPR-диагноз туберкулез со 100% чувствительностью

В Science Advances вышла работа про портативный тест на туберкулёз, который можно делать прямо с мокроты, без сложного оборудования. В одной пробирке объединены изотермическое усиление ДНК и считывание системой CRISPR; сразу проверяются две консервативные вставки M. tuberculosis (IS6110 и IS1081) плюс человеческий ген как внутренний контроль образца. В небольшой «слепой» проверке на клинических пробах тест дал 100% чувствительности (6/6) и 100% специфичности (7/7) по сравнению с культурой; предел обнаружения — ~69–81 КОЕ/мл в смоделированной мокроте. Результат можно увидеть на бумажной тест-полоске, а реагенты — лиофилизовать (хранение без «холодовой цепи»). 

Фон

По данным ВОЗ, в 2023 году от ТБ умерло около 1,25 млн человек; ТБ вновь стал ведущей инфекционной причиной смерти. Оценочное число заболевших — порядка 10,8 млн. Это делает доступную и быструю диагностику критически важной, особенно в странах с ограниченными ресурсами. 

• Текущие тесты — компромисс точности, скорости и цены. «Золотой стандарт» культура — очень точна, но медленная; микроскопия — быстрая, но малочувствительная; ПЦР-платформы вроде Xpert MTB/RIF Ultra заметно чувствительнее (LOD ≈ 15,6 КОЕ/мл), однако требуют дорогого оборудования и картриджей, что ограничивает охват. 
• Почему изотермика и CRISPR. Изотермическое усиление RPA работает при 37–42 °C и не требует термоциклеров — удобно «в поле». CRISPR-считывание (Cas12/13) добавляет видоспецифичность и позволяет делать визуальный латеральный поток («полоску») без сложной оптики. В сумме это путь к портативным и дешёвым ПВР-тестам.
• Почему сразу две мишени МБТ (IS6110 + IS1081). IS6110 — мультикопийная вставка комплекса M. tuberculosis, но у части линий копий мало, и тесты только на IS6110 могут «промахиваться». Добавление второй вставки IS1081 снижает риск ложно-отрицательных результатов.
• Зачем внутренний контроль человека. В дыхательных образцах бывают ингибиторы и «плохие» пробы. Эндогенный человеческий контроль (например, RNase P/геномная ДНК) подтверждает, что материал адекватный и реакция не заглушена — иначе результат нельзя считать отрицательным. 
• Однопробирочный («one-pot») формат важен сам по себе. Он сокращает шаги, уменьшает риск контаминации и облегчает работу вне лаборатории. Такие подходы для ТБ уже показывали жизнеспособность; новая работа доводит идею до формата с двойной мишенью и внутренним контролем, плюс демонстрирует лиофилизацию реагентов и полоску для считывания. 
• Чем именно ценна текущая статья. Авторы показали детекцию прямо из мокроты после максимально упрощённой подготовки проб, предел обнаружения на уровне ~70–80 КОЕ/мл в моделированной мокроте и 100% чувствительность/специфичность на небольшом слепом наборе клинических образцов — хороший «техдемо» для дальнейших многоцентровых валидаций. 

Как это работает

• Учёные совместили RPA (быстрое изотермическое умножение генетического материала при 37 °C) с «режущими» ферментами Cas13a/Cas12a. Подобрав направляющие РНК, они настроили систему на две мишени МБТ одновременно, а параллельно — на человеческую ДНК (проверка, что в пробе вообще есть материал и реакция не «заглохла»). 
• Вся химия идёт в одной пробирке; после инкубации результат считывают либо флуориметром, либо на полоске формата «латеральный поток» — по сути, как экспресс-тест. 
• Обработку мокроты упростили до нагрева и краткой центрифуги — без экстракторов нуклеиновых кислот. Для самых ограниченных условий авторы обсуждают даже ручные альтернативы центрифуге.

Что показали испытания

• Лимит обнаружения: 69,0 КОЕ/мл (штамм H37Rv) и 80,5 КОЕ/мл (BCG) в «зашп spike’енной» мокроте. Кросс-реактивности с другими бактериями/грибами не выявили. 
• Клиника (ослеплённые образцы): на 13 пробах из реальной практики — 100% чувствительность (6/6) и 100% специфичность (7/7) относительно посева. Для сравнения, на этом же наборе GeneXpert Ultra показал 100%/86% соответственно. 
• Технические нюансы: из двух вариантов считывания лучше сработал Cas13a (для «one-pot» формата он чувствительнее, чем Cas12a). Плюс параллельная проверка двух мишеней Mtb снижает риск ложных результатов. 

Зачем это нужно

Сегодняшние тесты — компромисс между точностью, скоростью и доступностью: посев очень точен, но медленный; мазок быcтр, но неточен; ПЦР-системы вроде GeneXpert точны и быстры, но требуют дорогих приборов и картриджей. Новый CRISPR-подход стремится закрыть «дыру»: полевая диагностика, работающая при 37 °C, со считыванием на бумажной полоске и потенциалом хранить реагенты без холодильника. 

Ограничения и что дальше

Это ранняя демонстрация на небольшом клиническом наборе — нужны большие, многоцентровые проверки (в т. ч. при ВИЧ-коинфекции, у детей, при малобациллярных формах и разных линиях МБТ). Авторы отдельно отмечают, что в самой «полевой» версии придётся заменить настольную центрифугу на полностью ручное решение. Но сама архитектура — «две мишени + внутренний контроль» в одной пробирке — уже доказала работоспособность и даёт понятный путь к доработке под массовое применение. 

Источник: Alexandra G. Bell и соавт. A streamlined CRISPR-based test for tuberculosis detection directly from sputum, Science Advances, онлайн 6 августа 2025 г. (Vol. 11, Issue 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206