Применение клеточных технологий для улучшения вида рубцов

Современная наука характеризуется бурным развитием ряда смежных дисциплин, объединенных под общим названием «биотехнология». Этот раздел науки, основываясь на последних достижениях в области биологии, цитологии, молекулярной генетики, генной инженерии, трансплантантологии, ставит своей целью использовать огромный потенциал, заложенный в растительных и животных клетках - основных структурных единицах всего живого. «Живая клетка представляет собой готовый биотехнологический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и ряд других, способствующих поддержанию каталитической активности системы на высоком уровне», - Джон Вудворд, 1992. Начало науки о клетке было положено в 1665 г., когда английский физик Р.Гук создал первый микроскоп и в пробке обнаружил ячейки - cellulae («клетки»). В 1829 г. М.Шлейден и Т.Шванн обосновали «клеточную теорию», которая доказывала, что все живое состоит из клеток. Р.Вирхов в 1858 г. доказал, что в основе всех болезней лежит нарушение структурной организации и метаболизма клеток. Он стал основателем «клеточной патологии». Основополагающий вклад в науку о клетке внесли в 1907-1911 гг. Р.Гаррисон и А.А.Максимов, доказав возможность культивирования клеток вне организма. Их работы показали, что для культивирования клеток, животные ткани и части растений должны быть механически разъединены до маленьких кусочков. Для выделения клеток ткани срезаются острым ножом или микротомом тонкими срезами, приблизительно 0,5-1,0 мм. Физическое разделение клеток называется иммобилизацией. Изолированные клетки получают ферментативным диспергированием кусочков растений или тканей. После размельчения острыми ножницами, кусочки обрабатывают трипсином или коллагеназой для получения суспензии - взвеси отдельных клеток или их микроагрегатов в специальной среде. Для иммобилизации растительных клеток широко используются альгинатные гели (альгинат кальция). Доказано, что иммобилизованные растительные и животные клетки сохраняют способность к биосинтезу. Продукты клеточного биосинтеза накапливаются в клетках, их экспрессия происходит либо спонтанно, либо с помощью специальных веществ, способствующих повышению проницаемости клеточных мембран.

Культивирование животных клеток - значительно более сложный процесс, чем культивирование растительных клеток, требующий специальной современной аппаратуры, высоких технологий, наличия различных сред, факторов роста, предназначенных для сохранения жизнеспособности клеток и поддержания их в состоянии высокой функциональной активности. Было обнаружено, что большинство клеток твердых тканей, таких, как ткани почек, печени, и кожи являются поверхностно зависимыми, поэтому in vitro их можно культивировать только в виде тонких пластов или монослоев, непосредственно связанных с поверхностью подложки. Длительность жизни, пролиферация и функциональная стабильность клеток, полученных ферментативным диспергированием тканей, в большой степени зависит от подложки, на которой они выращиваются. Известно, что все клетки, полученные из тканей позвоночных обладают отрицательным поверхностным зарядом, поэтому для их иммобилизации подходят положительно заряженные подложки. Изолированные клетки, полученные непосредственно из целых тканей можно поддержать в первичной культуре в иммобилизованном состоянии при сохранении высокой специфичности и чувствительности в течение 10-14 суток. Иммобилизованные, поверхностно-зависимые клетки играют на сегодняшний день большую роль в биологии, особенно их роль важна для клинических исследований. Их применяют для изучения циклов развития клеток, регуляции их роста и дифференцировки, функциональных и морфологических отличий между нормальными и опухолевыми клетками. Иммобилизованные монослои клеток используют в биотестах, для количественного определения биологически активных веществ, а также для изучения на них действия различных лекарственных препаратов и токсинов. Большой интерес к клетке, как к лечебному средству уже не одно десятилетие проявляют врачи всех специальностей. В этом направлении и бурно развиваются в настоящее время клеточные технологии.

С началом тканевой и клеточной терапии связано имя знаменитого отечественного ученого В.П. Филатова, который в 1913 г заложил основы учения о тканевой терапии, изучая результаты пересадок роговицы здоровых доноров больным с катарактой.. В процессе работы с трансплантацией роговицы, он обнаружил, что роговица, консервированная на холоде в течение 1-3 суток при температуре -2-4 градуса С приживается лучше, чем свежая. Так было обнаружено свойство клеток выделять в неблагоприятных условиях какие-то   вещества,   которые   возбуждают  жизненные   процессы   в трансплантируемых тканях и регенеративные в тканях реципиента. Ткань и клетки, отделенные от организма находятся в состоянии переживания, то есть замедленной жизнедеятельности. В них прекращается кровообращение, а следовательно и питание. Крайне затруднено тканевое дыхание, расстроена иннервация и трофика. Находясь в новом качественном состоянии, приспосабливаясь к новым условиям существования клетки вырабатывают особые вещества, обладающие лечебными свойствами. Эти вещества небелковой природы были названы В.П.Филатовым биогенными стимуляторами. Он установил совместно с В.В.Скородинской, что материал от животных и растений свободно можно автоклавировать при t 120 градусов С в течение часа после выдерживания в неблагоприятных условиях, при этом они не только не теряли активность, а наоборот ее усиливали, что объяснялось выходом биологических стимуляторов из консервированных тканей. Кроме того, они теряли антигенные свойства, что значительно снижало возможность отторжения. Консервированный стерильный материал вводился в организм методом имплантации (подсадки) под кожу или в виде инъекций экстрактов, с получением адекватных результатов. Было также обнаружено, что фетальные ткани содержат значительно большее количество биологически активных веществ, чем ткани взрослых особей, а некоторые факторы встречаются только у эмбрионов. Инокулированные фетальные ткани не воспринимаются организмом реципиента, как чужеродные в связи с отсутствием в составе цитоплазматических мембран протеинов, отвечающих за видовую, тканевую и индивидуальную специфичность (белков главного комплекса гистосовместимости). В результате инокуляция в организм человека фетальных тканей животных не запускает механизмов иммунологической защиты и реакции несовместимости и отторжения. В.П.Филатовым в лечебной практике широко использовалась плацента человека и кожа. Курсы лечения состояли из 30-45 инъекций тканевых экстрактов и 1-2 имплантаций автоклавированных тканей.

Начав исследования с человеческих и животных тканей и клеток, свои обобщения он перенес и на растительный мир. Производя опыты с живыми частями растений (алоэ, подорожник, агава, ботва свеклы, зверобой и др), он создавал для них неблагоприятные условия, помещая срезанные листья в темное место, поскольку для жизнедеятельности растению необходим свет. Из лиманной грязи и торфов им также были выделены биогенные стимуляторы, благодаря тому, что грязь и торф образуются при участии микрофлоры и микрофауны.

Новый виток своего развития тканевая терапия получила в конце 70-х годов, когда накопленные десятилетиями знания и опыт позволили на качественно новом уровне использовать животные и растительные ткани и клетки для лечения человека и продления его активного долголетия. Так в некоторых отечественных клиниках и ряде зарубежных женщинам в физиологической менопаузе с климактерическим синдромом или на фоне овариэктомиии для замедления процессов старения, развития атеросклероза, остеопороза, дисфункций со стороны иммунной, эндокринной и нервной систем стали проводить тканевую терапию фетальными тканями плаценты, гипоталамуса, печени, яичников, вилочковой и щитовидной желез. В одной из самых престижных геронто-косметологических клиник западной Европы для этих же целей уже не одно десятилетие используют инъекции экстрактов, полученных из фетальных тканей половых желез баранов.

В нашей стране биостимулирующее лечение также получило широкое применение. Пациентам с различными заболеваниями до недавнего времени активно назначали инъекции экстрактов плаценты, алоэ, коланхое, очитка большого (биосед), ФиБС, пелоидодистиллят, пелоидин, торфот, гумизоль приготовленных по методике В.П.Филатова. В настоящее время в аптеках практически не возможно купить эти высокоэффективные и недорогие отечественные тканевые препараты животного, растительного и минерального происхождения.

В основе получения различных биогенных препаратов из тканей и органов человека импортного производства, таких как румалон (из хрящевой ткани и костного мозга), актовегин (из крови телят), солкосерил (экстракт крови крупного рогатого скота), а также отечественных препаратов - стекловидное тело (из стекловидного тела глаза скота), керакол (из роговицы крупного рогатого скота), спленин (из селезенки крупного рогатого скота), эпиталямин (из эпиталямо-эпифизарной области) также лежат исследования В.П.Филатова. Объединяющим для всех тканевых препаратов свойством является общее воздействие на весь организм в целом. Таким образом, «Тканевая терапия» академика В.П.Филатова легла в основу большинства современных разработок и направлений в хирургии, иммунологии, акушерстве и гинеколоии, геронтологии, комбустиологии, дерматологии и косметологии, связанных с клеткой и продуктами ее биосинтеза.

Проблема пересадки тканей волновала человечество с древних времен. Так в папирусе Эберса, датированном 8 000 г. до н.э уже есть упоминание о применении пересадки тканей с целью возмещения дефектов отдельных участков тела. В «Книге жизни» индийского ученого Сушрута, жившего за 1 000 л. до н.э. имеется подробное описание восстановления носа из кожи щек и лба.

Потребность в донорской коже росла пропорционально увеличению количества пластических и реконструктивных операций. В связи с этим стали использовать трупную и фетальную кожу. Возникла необходимость в консервировании донорских ресурсов и изысканию возможностей замены человеческой кожи тканями животных, различными вариантами моделирования кожи. И именно в этом направлении работали ученые, когда в 1941 году P.Medovar впервые показал принципиальную возможность роста кератиноцитов in vitro. Следующим важным этапом в развитии клеточных технологий стала работа Karasek M. и Charlton M., которые в 1971 г. осуществили первую успешную трансплантацию аутологичных кератиноцитов из первичной культуры на раны кроликов, применив в качестве подложки для культивирования КЦ коллагеновый гель, что позволило улучшить пролиферацию клеток в культуре. J.Rheinvvald. H Green. разработали технологию серийного культивирования больших количеств кератиноцитов человека. В 1979 г. Green с соавторами открыли перспективы лечебного применения клеточной культуры кератиноцитов в восстановлении кожных покровов при обширных ожогах, после чего эта методика, постоянно совершенствуясь, стала использоваться хирургами ожоговых центров за рубежом и в нашей стране.

В процессе изучения живой клетки было выявлено, что клетки вырабатывают не только биогенные стимуляторы небелкового происхождения, но и целый ряд цитокинов, медиаторов, факторов роста, полипептидов, которые играют важную роль в регуляции гомеостаза всего организма. Было обнаружено, что, в различных клетках и тканях содержатся пептидные биорегуляторы. которые обладают широким спектром биологического действия и координируют процессы развития и функционирования многоклеточных систем. Началась эпоха применения культуры клеток в качестве лечебного средства. В нашей стране тансплантацию суспензии фибробластов и многослойных клеточных пластов кератиноцитов в последние десятилетия взяли на вооружение в комбустиологии. Такой активный интерес к пересадке клеток кожи обожженным объясняется необходимостью быстрого закрытия больших ожоговых поверхностей и дефицита донорской кожи. Возможность из небольшого по величине кусочка кожи выделить клетки, способные покрыть раневую поверхность в 1000 и даже в 10 000 раз превышающую площадь донорской кожи оказалась очень привлекательной и важной для комбустиологии и ожоговых больных. Процент приживляемости пластов кератиноцитов варьирует в зависимости от площади ожога, возраста и состояния здоровья пациента от 71.5 до 93,6%. Интерес к трансплантации кератиноцитов и фибробластов связан не только с возможностью быстро закрыть дефект в коже, но и с тем, что эти трансплантанты обладают мощным биологически активным потенциалом для улучшения вида тканей, полученных в результате пересадок. Новообразование сосудов, снятие гипоксии, улучшение трофики, ускорение созревания незрелой ткани - вот морфо-функциональная основа этих положительных изменений, происходящих благодаря выделению пересаженными клетками факторов роста и цитокинов. Таким образом, благодаря внедрению в лечебную практику прогрессивных клеточных технологий по пересадке многоклеточных пластов аутологичных и аллогенных кератиноцитов и фибробластов на обширные раневые поверхности, комбустиологи получили возможность не только уменьшить процент смертности обожженных с большим процентом поражения кожи, но и качественно улучшить рубцовую ткань, которая неизбежно возникает на месте ожогов IIб и IIIа и б степеней. Опыт комбустиологов, полученный при лечении раневых поверхностей у ожоговых пациентов подсказал идею использовать, уже модифицированный метод Грина, в дермато-хирургической практике при различной кожной и косметологической патологии (трофические язвы, витилиго, невусах, буллезном эпидермолизе, при удалении татуировок, возрастных изменениях кожи, а также для улучшения вида рубцов).

Использование аллогенных кератиноцитов в хирургии, комбустиологии и дерматокосметологии имеет ряд преимуществ перед применеием аутологичных кератиноцитами, так как клеточный материал может быть приготовлен заранее в неограниченных объемах, консервирован и применен в случае необходимости. Известно также, что аллогенные КЦ обладают сниженной антигенной активностью, так как при культивировании in vitro теряют клетки Лангерганса, являющиеся носителями антигенов комплекса HLA. В пользу применения аллогенных КЦ говорит также то, что они замещаются аутологичными после пересадки, по данным разных авторов в сроки от 10 дней до 3-х месяцев. В связи с этим сегодня во многих странах созданы банки клеток, благодаря которым можно получать клеточные трансплантанты в нужном количестве и в нужный момент. Такие банки есть в Германии, США, Японии.

Интерес к применению клеточных технологий в дерматокосметологии связан с тем, что «клеточные композиции» несут в себе мощный биоэнергетический и информационный потенциал, благодаря которому возможно получение качественно новых результатов лечения. Выделяемые пересаженными клетками аутокины (факторы роста, цитокины, окись азота и др.), в первую очередь действуют на собственные фибробласты, повышая их синтетическую и пролиферативную активность. Этот факт является особенно привлекательным для исследователей, так как фибробласт является ключевой клеткой дермы, от функциональной активности которого зависит состояние всех слоев кожи. Известно также, что после травмирования кожи каутером, лазером, иглой и другими инструментами, из костного мозга, жировой ткани и перицитов капилляров происходит пополнение кожи свежими стволовыми предшественниками фибробластов, что способствует «омоложению» пула собственных клеток. Они активно начинают синтезировать коллаген, эластин, ферменты, гликозаминогликаны, факторы роста и другие биологически активные молекулы, что и приводит к повышению гидратации и васкуляризации дермы, улучшению ее прочности,