Медицинский эксперт статьи
Новые публикации
Гемопоэтические стволовые клетки
Последняя редакция: 23.04.2024
Весь контент Web2Health проверяется медицинскими экспертами, чтобы обеспечить максимально возможную точность и соответствие фактам.
У нас есть строгие правила по выбору источников информации и мы ссылаемся только на авторитетные сайты, академические исследовательские институты и, по возможности, доказанные медицинские исследования. Обратите внимание, что цифры в скобках ([1], [2] и т. д.) являются интерактивными ссылками на такие исследования.
Если вы считаете, что какой-либо из наших материалов является неточным, устаревшим или иным образом сомнительным, выберите его и нажмите Ctrl + Enter.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), как и мезенхимальные клетки-предшественники, характеризуются мультипотентностью и дают начало клеточным линиям, конечные элементы которых образуют форменные элементы крови, а также ряд специализированных тканевых клеток иммунной системы.
Гипотеза о наличии общего предшественника всех клеток крови, как и сам термин “стволовая клетка", принадлежит А. Максимову (1909). Потенциал образования клеточной массы у ГСК огромен - стволовые клетки костного мозга ежедневно продуцируют 10й клеток, составляющих форменные элементы периферической крови. Сам факт существования гемопоэтических стволовых клеток был установлен в 1961 году в экспериментах по восстановлению гемопоэза у мышей, получивших смертельную дозу радиоактивного облучения, разрушающего стволовые клетки костного мозга. После трансплантации клеток сингенного костного мозга таким летально облученным животным в селезенке реципиентов были обнаружены дискретные очаги кроветворения, источник которых - единичные клоногенные клетки-предшественники.
Затем была доказана способность гемопоэтических стволовых клеток к самоподдержанию, обеспечивающая функцию кроветворения в процессе онтогенеза. В процессе эмбрионального развития ГСК отличаются высокой миграционной активностью, необходимой для их перемещения в зоны закладки кроветворных органов. Это свойство ГСК сохраняют и в онтогенезе - за счет их постоянной миграции происходит перманентное обновление пула иммунокомпетентных клеток. Способность ГСК к миграции, проникновению сквозь гистогематические барьеры, имплантации в тканях и клоногенному росту послужила основой для трансплантации клеток костного мозга при целом ряде заболеваний, связанных с патологией системы кроветворения.
Как и все стволовые клеточные ресурсы, гемопоэтические стволовые клетки присутствуют в своей нише (костном мозге) в весьма незначительных количествах, что обуславливает определенные трудности при их выделении. Иммунофенотипически ГСК человека характеризуются как СD34+NК-клетки, способные мигрировать в кровеносное русло и заселять органы иммунной системы или же репопулировать строму костного мозга. Нужно четко представлять, что ГСК не являются наиболее незрелыми клетками костного мозга, а происходят от предшественников, к которым относят дормантные фибробластоподобные СБ34-негативные клетки. Установлено, что клетки с фенотипом СD34 способны к выходу в общий кровоток, где меняют свой фенотип на СD34+, но при обратной миграции в костный мозг под влиянием микроокружения вновь становятся СD34-негативными стволовыми клеточными элементами. В состоянии покоя СD34~-клетки не реагируют на паракринные регуляторные сигналы стромы (факторы роста, цитокины). Однако в ситуациях, требующих усиления интенсивности кроветворения, стволовые клетки с фенотипом СD34 отвечают на дифференцировочные сигналы образованием как гемопоэтических, так и мезенхимальных клеток-предшественников. Кроветворение осуществляется при непосредственном контакте ГСК с клеточными элементами стромы костного мозга, представленной сложной сетью макрофагов, ретикулярных эндотелиальных клеток, остеобластов, стромальных фибробластов и внеклеточным матриксом. Стромальная основа костного мозга - не всего лишь матрица или “скелет” для гемопоэтической ткани, она осуществляет тонкую регуляцию гемопоэза за счет паракринных регуляторных сигналов факторов роста, цитокинов и хемокинов, а также обеспечивает адгезивные взаимодействия, необходимые для образования клеток крови.
Таким образом, в основе постоянно обновляющейся системы гемопоэза лежит полипотентная (с точки зрения кроветворения) гемопоэтическая стволовая клетка, способная к длительному самоподдержанию. В процессе коммитирования ГСК подвергаются первичной дифференцировке и образуют клоны клеток, отличающихся по цитоморфологическим и иммунофенотипическим характеристикам. Последовательное формирование примитивных и коммитированных клеток-предшественников завершается образованием морфологически идентифицируемых клеток-родоначальниц различных гемопоэтических линий. Результатом последующих этапов сложного многостадийного процесса кроветворения является дозревание клеток и выход в периферическую кровь зрелых форменных элементов - эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов и тромбоцитов.
[Источники гемопоэтических стволовых клеток
Гемопоэтические стволовые клетки считаются наиболее изученным стволовым источником, что во многом связано с их использованием в клинике при трансплантации костного мозга. На первый взгляд, об этих клетках известно достаточно много. В какой-то мере это соответствует действительности, поскольку промежуточные и зрелые потомки ГСК - наиболее доступные клеточные элементы, каждый из которых (эритроциты, лейкоциты, лимфоциты, моноциты/макрофаги и тромбоциты) тщательно изучался на всех уровнях - от световой до электронной микроскопии, от биохимических и иммунофенотипических характеристик до идентификации методами ПЦР-анализа. Однако проведенный мониторинг морфологических, ультраструктурных, биохимических, иммунофенотипических, биофизических и геномных параметров ГСК так и не позволил получить ответы на многие проблемные вопросы, решение которых необходимо для развития клеточной трансплантологии. До сих пор не установлены механизмы стабилизации ГСК в дормантном состоянии, их активации, выхода на этап симметричного или асимметричного деления, а главное - коммитирования к образованию настолько функционально разных форменных элементов крови, как эритроциты, лейкоциты, лимфоциты и тромбоциты.
Наличие в костном мозге клеток с фенотипом СD34, которые являются родоначальниками как мезенхимальных, так и гемопоэтических стволовых клеток, поставило вопрос о существовании наиболее ранних, приближенных к СD34-негативным клеткам предшественников клеточной дифференцировки в стромальную и гемопоэтическую линии. Методом длительного культивирования была получена так называемая долгосрочная культура “инициирующих'’ клеток (long-term culture-initiating cell - LTC-IC). Время жизни таких клеток-предшественников с колониеобразующей активностью на стромальной основе костного мозга при определенном сочетании факторов роста превышает 5 недель, тогда как жизнеспособность коммитированных колониеобразующих единиц (КОЕ) в культуре составляет всего 3 недели. В настоящее время считается, что LTC-IC - функциональный аналог ГСК, поскольку при высоком репопуляционном потенциале около 20% LTC-IC характеризуются фенотипом CD34+CD38- и проявляют высокую способность к самообновлению. Такие клетки встречаются в костном мозге человека с частотой 1:50 000. Однако наиболее близкими к ГСК следует признать миелоидо-лимфоидоинициирующие клетки, которые получают в условиях долгосрочного (15 недель) культивирования. Такие клетки, обозначенные как LTC, среди клеток костного мозга человека встречаются в 10 раз реже, чем LTC-IC, и формируют клеточные линии как миелоидного, так и лимфоидного ростков кроветворения.
Хотя маркировка гемопоэтических стволовых клеток с помощью моноклональных антител с последующей иммунофенотипической идентификацией является основным методом опознавания и избирательной сортировки кроветворных клеток со стволовым потенциалом, клиническое применение выделенных таким образом ГСК ограничено. Блокировка антителами рецептора CD34 или других маркерных антигенов в процессе иммунопозитивного сортинга неизбежно изменяет свойства клетки, выделенной с его помощью. Более предпочтительным считается иммунонегативное выделение ГСК на магнитных колонках. Однако и в этом случае для сортировки, как правило, используются моноклональные антитела, фиксированные на металлическом носителе. Кроме того, что немаловажно, оба метода выделения ГСК основаны на фенотипических, а не на функциональных характеристиках. Поэтому многие исследователи предпочитают использовать анализ клоногенных параметров ГСК, что позволяет по размеру и составу колоний определить степень зрелости и направление дифференцировки клеток-предшественников. Известно, что в процессе коммитирования количество клеток и число их типов в колонии уменьшается. Гемопоэтическая стволовая клетка и ее ранняя дочерняя клетка, получившая название “гранулоцито-эритроцито-моноцито-мегакариоцитоколониеобразующая единица” (СFU-GЕММ), создают в культуре большие мультилинейные колонии, содержащие, соответственно, гранулоциты, эритроциты, моноциты и мегакариоциты. Находящаяся ниже по линии коммитирования гранулоцито-моноцитоколониеобразующая единица (СFU-GМ) формирует колонии гранулоцитов и макрофагов, а гранулоцитарная колониеобразующая единица (СFU-G) - только мелкую колонию зрелых гранулоцитов. Ранний эритроцитарный предшественник - бурстообразующая единица эритроцитов (СFU-Е) - является источником крупных, а более зрелая колониеобразующая единица эритроцитов (СFU-Е) - мелких эритроцитарных колоний. В общей совокупности, при росте клеток на полутвердых средах можно идентифицировать клетки, образующие шесть типов миелоидных колоний: СFU-GЕММ, СFU-GМ, СFU-G, СFU-М, ВFU-Е и СFU-Е).
Однако кроме производных гемопоэза любой исходный материал для выделения ГСК содержит значительное количество сопутствующих клеток. В связи с этим необходима предварительная очистка трансплантата, в первую очередь, от активных клеток иммунной системы донора. Обычно для этого применяют иммуноселекцию, основанную на экспрессии лимфоцитами специфических антигенов, что дает возможность их выделять и удалять с помощью моноклональных антител. Кроме того, разработана иммунорозеточная методика Т-лимфоцитарного истощения трансплантата костного мозга, которая базируется на образовании комплексов СD4+-лимфоцитов и специфических моноклональных антител, эффективно удаляемых при помощи афереза. Данная методика обеспечивает получение очищенного клеточного материала с 40-60% содержанием гемопоэтических стволовых клеток.
Увеличение числа клеток-предшественников за счет удаления зрелых форменных элементов крови из продукта лейкафереза достигается путем противоточного центрифугирования с последующей фильтрацией (в присутствии хелатора - тринатрия цитрата) через колонки, содержащие нейлоновые волокна, покрытые иммуноглобулином человека. Последовательное применение этих двух методик обеспечивает полное очищение трансплантата от тромбоцитов, на 89% - от эритроцитов и на 91% - от лейкоцитов. Благодаря значительному снижению потерь ГСК уровень СD34+-клеток в общей клеточной массе удается повысить до 50%.
Для функциональной характеристики выделенных гемопоэтических стволовых клеток используют их способность создавать колонии зрелых форменных элементов крови в культуре. Анализ сформированных колоний позволяет идентифицировать и количественно оценить типы клеток-предшественников, степень их коммитирования, а также установить направление их дифференцировки. Клоногенная активность определяется в полутвердых средах на метилцеллюлозе, агаре, плазменном или фибриновом геле, снижающих миграционную активность клеток, что предотвращает их прикрепление к поверхности стекла или пластика. В оптимальных условиях культивирования клоны из одиночной клетки развиваются за 7-18 дней. При наличии в клоне менее 50 клеток он идентифицируется как одиночный кластер, если число клеток превышает 50 - как колония. Учитывается количество клеток, способных образовать колонию (колониеобразующие единицы - КОЕ или колониеобразующие клетки - КОК). Следует заметить, что параметры КОЕ и КОК не соответствуют количеству ГСК в клеточной суспензии, хотя и коррелирует с ним, что еще раз подчеркивает необходимость определения функциональной (колониеобразующей) активности ГСК in vitro.
Среди клеток костного мозга гемопоэтические стволовые клетки обладают наиболее высоким пролиферативным потенциалом, за счет чего формируют в культуре самые большие по размеру колонии. По числу таких колоний предлагается косвенно определять количество стволовых клеток. После образования in vitro колоний, превышающих в диаметре 0,5 мм и с численностью клеток более 1000, авторы провели тестирование таких клеток на устойчивость к сублетальным дозам 5-фторурацила и изучили их способность к репопуляции костного мозга смертельно облученных животных. По указанным параметрам выделенные клетки почти не отличались от ГСК и получили аббревиатурный символ HPP-CFC - колониеобразующие клетки с высоким пролиферативным потенциалом.
Поиск возможностей более качественного выделения гемопоэтических стволовых клеток продолжается. Однако стволовые кроветворные клетки морфологически подобны лимфоцитам и представляют собой относительно однородную совокупность клеток с почти круглыми ядрами, мелкодисперсным хроматином и небольшим количеством слабобазофильной цитоплазмы. Точное их количество определить тоже сложно. Допускается, что ГСК в костном мозге человека встречаются с частотой 1 на 106 ядросодержащих клеток.
Идентификация гемопоэтических стволовых клеток
Для улучшения качества идентификации гемопоэтических стволовых клеток проводится последовательное или одновременное (на многоканальном сор- тере) исследование спектра мембранносвязанных антигенов, причем в ГСК фенотип CD34+CD38 должен сочетаться с отсутствием маркеров линейной дифференцировки, особенно антигенов иммунокомпетентных клеток, таких как CD4, поверхностные иммуноглобулины и гликофорин.
Практически все схемы фенотипирования гемопоэтических стволовых клеток включают определение антигена CD34. Этот гликопротеид с молекулярной массой около 110 кДа, несущий несколько сайтов гликозилирования, экспрессируется на плазматической клеточной мембране после активации соответствующего гена, локализованного на 1-й хромосоме. Функция молекулы CD34 связана с L-селектинопосредованным взаимодействием ранних клеток-предшественников кроветворения со стромальной основой костного мозга. Однако следует помнить, что наличие антигена CD34 на поверхности клетки позволяет произвести только предварительную оценку содержания ГСК в клеточной суспензии, поскольку он экспрессируется и другими клетками-предшественниками гемопоэза, а также стромальными клетками костного мозга и эндотелиальными клетками.
В процессе дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников экспрессия CD34 перманентно снижается. Эритроцитарные, гранулоцитарные и моноцитарные коммитированные клетки-предшественники либо слабо экспрессируют антиген CD34, либо он на их поверхности вообще отсутствует (фенотип CD34 ). На поверхностной мембране дифференцированных клеток костного мозга и зрелых форменных элементов крови антиген CD34 не выявляется.
Надо заметить, что в динамике дифференцировки кроветворных клеток-предшественников не только снижается уровень экспрессии CD34, но и параллельно прогрессивно повышается экспрессия антигена CD38 - интегрального мембранного гликопротеида с молекулярной массой 46 кДа, обладающего NAD-гликогидролазной и ADP-рибозилциклазной активностью, что предполагает его участие в транспорте и синтезе ADP-рибозы. Таким образом, появляется возможность двойного контроля степени коммитирования кроветворных клеток-предшественников. Популяция клеток с фенотипом CD34+CD38+, составляющая от 90 до 99% СD34-позитивных клеток костного мозга, содержит клетки-предшественники с ограниченным пролиферативным и дифференцировочным потенциалом, тогда как клетки с фенотипом CD34+CD38 могут претендовать на роль ГСК.
Действительно, популяция клеток костного мозга, описываемая формулой CD34+CD38-, содержит относительно большое количество примитивных стволовых клеток, способных дифференцироваться в миелоидном и лимфоидном направлениях. В условиях длительного культивирования клеток с фенотипом CD34+CD38- удается получить все зрелые форменные элементы крови: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, мегакариоциты, эритроциты и лимфоциты.
Относительно недавно установлено, что СD34-позитивные клетки экспрессируют еще два маркера - АС133 и CD90 (Thy-1), которые также используются для идентификации гемопоэтических стволовых клеток. Антиген Thy-1 коэкспрессируется с рецептором CD117 (c-kit) на СD34+-клетках костного мозга, пуповинной и периферической крови. Это поверхностный фосфатидилинозитолсвязывающий гликопротеин с молекулярной массой 25-35 кДа, принимающий участие в процессах клеточной адгезии. Некоторые авторы считают, что антиген Thy-1 является маркером наиболее незрелых СD34-позитивных клеток. Самовоспроизводящиеся клетки с фенотипом CD34+Thy-1+ дают начало длительно культивируемым линиям с образованием дочерних клеток. Предполагается, что антиген Thy-1 блокирует регуляторные сигналы, вызывающие остановку клеточного деления. Несмотря на то что СD34+ТЬу1+-клетки способны к самовоспроизводству и созданию длительно культивируемых линий, их фенотип никак не может относиться исключительно к ГСК, поскольку содержание Thy-1+ в общей массе СD34-позитивных клеточных элементов составляет около 50%, что значительно превышает количество гемопоэтических клеток.
Более перспективным для идентификации гемопоэтических стволовых клеток следует признать АС133 - антигенный маркер клеток-предшественников гемопоэза, экспрессия которого впервые выявлена на клетках эмбриональной печени. АС133 - трансмембранный гликопротеид, который появляется на поверхности клеточной мембраны на самых ранних этапах созревания ГСК - не исключено, что даже раньше, чем антиген CD34. В исследованиях А. Петренко, В. Грищенко (2003) установлено, что АС133 экспрессируют до 30% СD34-позитивных клеток эмбриональной печени.
Таким образом, идеальный фенотипический профиль гемопоэтических стволовых клеток, по сегодняшним представлениям, складывается из клеточного абриса, в контурах которого должны присутствовать конфигурации антигенов CD34, АС133 и Thy-1, но нет места для молекулярных проекций CD38, HLA-DR и маркеров линейной дифференцировки GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.
Вариацией фенотипического портрета ГСК может быть комбинация CD34+CD45RalowCD71low, поскольку свойства клеток, описываемых данной формулой, не отличаются от функциональных параметров клеток с фенотипом CD34+CD38. Кроме того, ГСК человека можно опознать по фенотипическим приметам CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit /low - всего 30 таких клеток полностью восстанавливают кроветворение у смертельно облученных мышей.
С анализа общих фенотипических характеристик клеток костного мозга собственно и начался 40-летний период интенсивного исследования ГСК, одновременно способных как к самовоспроизводству, так и к дифференцировке в другие клеточные элементы, что позволило обосновать применение трансплантации костного мозга с целью лечения различной патологии системы кроветворения. Открытые позднее новые типы стволовых клеток пока еще широкого применения в клинической практике не получили. Вместе с тем, стволовые клетки пуповинной (кордовой) крови и эмбриональной печени способны значительно расширить масштабы клеточной трансплантации не только в гематологии, но и в других областях медицины, поскольку отличаются от ГСК костного мозга как количественными характеристиками, так и качественными признаками.
Объем стволовой гемопоэтической клеточной массы, необходимый для трансплантации, обычно получают из костного мозга, периферической и кордовой крови, а также из эмбриональной печени. Кроме того, клетки-предшественники гемопоэза можно получить in vitro путем размножения ЭСК с последующей их направленной дифференцировкой в кроветворные клеточные элементы. А. Петренко, В. Грищенко (2003) справедливо отмечают существенные отличия иммунологических свойств и способности к восстановлению кроветворения ГСК разного происхождения, что обусловлено неодинаковым соотношением содержащихся в их источниках ранних полипотентных и поздних коммитированных клеток-предшественников. Кроме того, гемопоэтическим стволовым клеткам, полученным из разных стволовых источников, присущи количественно и качественно совершенно иные ассоциации негемопоэтических клеток.
Уже традиционным источником гемопоэтических стволовых клеток является костный мозг. Суспензию клеток костного мозга получают из повздошной кости или грудины методом вымывания под местной анестезией. Полученная таким образом суспензия гетерогенна и содержит смесь ГСК, стромальных клеточных элементов, коммитированных клеток-предшественников миелоидной и лимфоидной линий, а также зрелые форменные элементы крови. Количество клеток с фенотипами CD34+ и CD34+CD38 среди мононуклеаров костного мозга составляет соответственно 0,5-3,6 и 0-0,5%. Периферическая кровь после G-CSF-индуцированной мобилизации ГСК содержит 0,4-1,6% CD34+ и 0-0,4% CD34+CD38 .
Более высок процент клеток с иммунофенотипами CD34+CD38 и CD34+ в пуповинной крови - 0-0,6 и ОД-2,6%, а их максимальное количество выявляется среди гемопоэтических клеток эмбриональной печени - 0,2-12,5 и 2,3-35,8%, соответственно.
Однако качество трансплантируемого материала зависит не только от количества содержащихся в нем СD34+-клеток, но и от их функциональной активности, которую можно оценить по уровню колониеобразования in vivo (репопуляция костного мозга у смертельно облученных животных) и in vitro - по росту колоний на полужидких средах. Оказалось, что колониеобразующая и пролиферативная активность гемопоэтических клеток-предшественников с фенотипом CD34+CD38 HLA-DR, выделенных из эмбриональной печени, фетального костного мозга и кордовой крови, значительно превышает пролиферативный и колониеобразующий потенциал кроветворных клеток костного мозга и периферической крови взрослого человека. Количественный и качественный анализ ГСК различного происхождения выявил значительные отличия как их относительного содержания в клеточной суспензии, так и функциональных возможностей. Максимальное количество СD34+-клеток (24,6%) обнаружено в трансплантационном материале, полученном из фетального костного мозга. Костный мозг взрослого человека содержит 2,1% СD34-позитивных клеточных элементов. Среди мононуклеарных клеток периферической крови взрослого человека всего 0,5% имеют фенотип CD34+, тогда как в кордовой крови их количество достигает 2%. При этом колониеобразующая способность СD34+-клеток фетального костного мозга в 2,7 раза превышает возможности клонального роста костномозговых гемопоэтических клеток взрослого человека, а клетки пуповинной крови формируют значительно больше колоний, чем кроветворные элементы, выделенные из периферической крови взрослых людей: 65,5 и 40,8 колоний/105 клеток, соответственно.
Различия пролиферативной активности и колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток связаны не только с разной степенью их зрелости, но и с их естественным микроокружением. Известно, что интенсивность пролиферации и скорость дифференцировки стволовых клеток определяется интегральным регуляторным воздействием многокомпонентной системы факторов роста и цитокинов, которые продуцируются как самими стволовыми клетками, так и клеточными элементами их матриксно-стромального микроокружения. Использование очищенных клеточных популяций и бессывороточных сред с целью культивирования клеток позволило охарактеризовать ростовые факторы, оказывающие стимулирующее и ингибирующее влияние на стволовые клетки различного уровня, клетки-предшественники и клетки, коммитированные в том или ином линейном направлении. Результаты проведенных исследований убедительно свидетельствуют о том, что ГСК, полученные из источников с разным уровнем онтогенетического развития, отличаются как фенотипически, так и функционально. Для ГСК, пребывающих на более ранних этапах онтогенеза, характерен высокий потенциал самовоспроизводства и высокая пролиферативная активность. Такие клетки отличаются большей длиной теломер и подвергаются коммитированию с образованием всех клеточных линий гемопоэза. Реакция иммунной системы на ГСК эмбрионального происхождения отсрочена, так как такие клетки слабо экспрессируют молекулы НLА. Существует четкая градация относительного содержания ГСК, их способности к самообновлению и количества образуемых ими типов линий коммитирования: СD34+-клетки эмбриональной печени > СD34+-клетки кордовой крови > СD34+-клетки костного мозга. Важно, что такие различия присущи не только интра-, нео- и раннему постанатальному периодам развития человека, но и всему онтогенезу - пролиферативная и колониеобразующая активность ГСК, полученных из костного мозга или периферической крови взрослого человека, обратнопропорциональна возрасту донора.