Бешенство у детей

Основным резервуаром и источником инфекции среди диких животных служат волки, лисицы, шакалы, летучие мыши, а среди домашних животных - собаки и кошки, редко - лошади, крупный рогатый скот, свиньи, крысы и др. Передача инфекции от человека человеку хотя и возможна, но бывает крайне редко. Это типичная зоонозная инфекция. Человек заражается бешенством главным образом от собак.

После укуса человека больным животным вирус размножается в мышечной ткани в месте укуса, а затем, достигнув окончаний чувствительных периферических нервов, распространяется центростремительно, достигая двигательных нейронов. Время продвижения вируса и поражения мозга зависят от места укуса. При тяжёлых укусах головы и лица вирус может достигать ЦНС за 15-20 сут, а при незначительных повреждениях кожных покровов туловища и конечностей и, следовательно, малой дозе возбудителя процесс продвижения вируса к ЦНС может задержаться на несколько месяцев или даже до 1-1,5 лет. Достигая ЦНС, вирус фиксируется в тканях головного и спинного мозга, преимущественно в нейронах продолговатого мозга, аммоновом роге, основании мозга. В спинном мозге более всего поражаются задние рога. Из ЦНС вирус центробежно по нервным стволам достигает слюнных желёз, где размножается и выделяется со слюной.

Понятия в патогенезе бешенства

RV имеет широкий круг хозяев и может инфицировать почти всех млекопитающих. Хотя сообщалось о нескольких путях передачи RV, естественное заражение чаще всего происходит через укус. Помимо укусов, потребление инфицированных RV тушек может способствовать инфицированию вируса бешенства у песцов, и было обнаружено, что контакт RV со слизистыми оболочками является еще одним возможным путем передачи. [9] В некоторых необычных обстоятельствах, таких как случайный выброс RV в виде аэрозоля в лаборатории или RV в виде аэрозоля в пещерах, населенных большим количеством летучих мышей, [10] может происходить передача через аэрозоль.

Пока не ясно, реплицируются ли уличные RV и адаптированные к мышам или адаптированные к культуре ткани штаммы RV в месте инокуляции до того, как они проникнут в ЦНС. В то время как экспериментальное внутримышечное заражение молодых хомяков или енотов уличным RV выявило репликацию RV в поперечнополосатых мышечных клетках до того, как вирус вторгся в аксоны мотонейронов через нервно-мышечные соединения, [11], [12] внутримышечное инфицирование мышей адаптированным к мышам CVS-24 RV показали, что RV мигрирует непосредственно в ЦНС без предварительной репликации в месте инокуляции. [13] После попадания в терминалы немиелинизированных аксонов RV ретроградно транспортируется к телу клетки.

Недавние открытия показывают, что транспорт аксональных пузырьков может представлять собой ключевую стратегию перемещения вирионов на большие расстояния в аксонах. [14] Было подсчитано, что RV мигрирует внутри аксонов со скоростью 3 мм / ч. [15] Затем инфекция распространяется через цепочку нейронов, соединенных синаптическими соединениями. Однако точный механизм, который способствует транссинаптическому распространению, все еще неизвестен. После заражения головного мозга вирус центробежно распространяется к периферической и вегетативной нервной системе во многих периферических органах. [16] На последней стадии инфекционного цикла RV мигрирует в слюнные железы; после репликации в мукогенных ацинарных клетках он попадает в слюну и готов к передаче следующему хозяину. [17]

Что касается патологии, вызванной вирусом бешенства, апоптотическая гибель клеток была предложена в качестве потенциального патогенного механизма в экспериментальных моделях бешенства мышей, инфицированных фиксированным штаммом RV. [18] Патогенным механизмом, который может способствовать глубокой дисфункции ЦНС, характерной для бешенства, может быть нарушение функций нейронов. Было показано, что экспрессия генов заметно снижена в нейронах, инфицированных RV, что приводит к общему подавлению синтеза белка, [19] а несколько исследований показали нарушение нейротрансмиссии после инфицирования RV. Цзян продемонстрировал, что связывание антагониста ацетилхолинового рецептора с инфицированными гомогенатами головного мозга крысы было снижено по сравнению с контролем. [20] В мозге крысы, инфицированной RV, также наблюдалось нарушение как высвобождения, так и связывания серотонина, нейромедиатора, участвующего в контроле цикла сна, восприятия боли и поведения. [21], [22] Помимо воздействия на нейротрансмиссию, инфекция правого желудочка может также влиять на ионные каналы. Инфицированные клетки нейробластомы мыши демонстрируют снижение функциональной экспрессии потенциал-зависимых натриевых каналов, что может предотвращать потенциалы действия и в конечном итоге приводить к функциональным нарушениям. [23]

В дополнение к отсутствию серьезных патологических поражений в ЦНС, в большинстве случаев человеческого бешенства через 7–10 дней после появления клинических признаков иммунный ответ не выявляется. Эти глубокие различия между патогенезом бешенства и патогенеза большинства других вирусных или бактериальных инфекций ЦНС дополнительно подтверждаются тем фактом, что иммуносупрессия либо не имеет эффекта, либо пагубно сказывается на исходе бешенства. [24] Низкий уровень иммунного ответа, часто наблюдаемый у жертв бешенства, вызывает недоумение, поскольку его нельзя объяснить слабой иммуногенностью антигенов RV. Фактически, RV G и белок нуклеокапсида являются мощными B- и T-клеточными антигенами при парентеральном введении. [25] Возможное объяснение низкой степени иммунного ответа против RV у людей или животных, страдающих бешенством, может заключаться в том, что RV-инфекция ЦНС вызывает иммуносупрессию, [26] и было предложено, что RV использует подрывную стратегию, включая предотвращение апоптоза и разрушение вторгающихся Т-клеток. [27]

Аттенуированные штаммы RV, которые были адаптированы к ненейрональным клеткам, значительно отличаются от патогенных штаммов уличных RV по их нейроинвазивности, которая относится к их способности проникать в ЦНС из периферических участков. В этом отношении адаптированные к культуре ткани штаммы RV либо не обладают, либо имеют лишь ограниченную способность вторгаться в ЦНС из периферических участков, тогда как штаммы уличных RV или адаптированные к мышам штаммы RV, такие как CVS-24, являются высокоинвазивными. [28] Ключевыми факторами, вовлеченными в нейроинвазию RV, являются захват вируса, аксональный транспорт, транс-синаптическое распространение и скорость репликации вируса.

До недавнего времени наши знания о патогенезе RV были ограниченными и в основном основывались на описательных исследованиях уличных штаммов RV или экспериментальном заражении ослабленными штаммами, адаптированными в лаборатории. Появление технологии обратной генетики позволило идентифицировать вирусные элементы, которые определяют патогенный фенотип RV, и лучше понять механизмы, участвующие в патогенезе бешенства.

Идентификация вирусных элементов, контролирующих захват, распространение и репликацию вируса бешенства

• Вирусные элементы, участвующие в захвате вируса

Инфекция RV начинается с прикрепления вируса к предполагаемому клеточному рецептору. Хотя несколько молекул мембранной поверхности были предложены в качестве рецепторов RV, включая никотиновый ацетилхолиновый рецептор, [29] молекулу адгезии нервных клеток [30] и низкоаффинный рецептор нейротропина p75 NTR, [31] до сих пор не ясно, действительно ли эти молекулы играют роль роль в жизненном цикле вируса бешенства. В этом контексте недавно было показано, что взаимодействие RV G – p75 NTR не является необходимым для инфицирования RV первичных нейронов. [32] После связывания с рецептором RV интернализуется посредством адсорбционного или рецепторно-опосредованного эндоцитоза. [33] Затем среда с низким pH внутри эндосомного компартмента вызывает конформационные изменения в RV G, которые запускают слияние вирусной мембраны с эндосомальной мембраной, тем самым высвобождая RNP в цитоплазму. [34] Что касается вирусов, RV G играет решающую роль в захвате вируса, скорее всего, через взаимодействие с предполагаемыми клеточными рецепторами, которые способствуют быстрому захвату. В этом отношении было продемонстрировано, что патогенность адаптированных к культуре ткани штаммов RV (например, ERA, HEP и CVS-11) коррелирует с наличием детерминанты, расположенной в антигенном сайте III G-белка. [35] Мутация Arg → Gln в положении 333 в этом антигенном сайте белка G ERA привела к семикратной задержке интернализации варианта Gln333 RV по сравнению с вариантом дикого типа. Мутация Asn 194 → Lys 194 в RV G, которая объясняет повторное появление патогенного фенотипа, была связана со значительным уменьшением времени интернализации. [36] Кроме того, эксперименты с химерными RV показали, что время, необходимое для интернализации вирионов RV, значительно увеличилось, а патогенность сильно снизилась после замены гена G высокопатогенного штамма SB RV, который был получен из клона кДНК, полученного из серебра. штамм RV-18, ассоциированный с летучими мышами, [37] с таковым из сильно аттенуированного штамма SN, который был выделен из клона кДНК вакцинного штамма SAD B19 RV. [38] Вместе эти данные подтверждают мнение о том, что кинетика поглощения вируса, которая является функцией G RV, является основным фактором, определяющим патогенность RV.

• Вирусные элементы, участвующие в распространении и переносе вирусов

Уникальным свойством вируса бешенства является его способность распространяться от клетки к клетке. Наблюдение за тем, что вариант Gln333 ERA теряет pH-зависимую активность слияния клеток in vitro [39] и демонстрирует сильно сниженную способность распространяться от клетки к клетке, [40] предполагает, что G RV также играет ключевую роль в распространение от клетки к клетке и, следовательно, перенос вируса, вероятно, за счет его фузиогенной активности. Эта возможность дополнительно подтверждается обнаружением того факта, что скорость распространения патогенного ревертанта RV SPBNGAK почти в два раза выше, чем определенная для непатогенного варианта SPBNGA. Интересно, что Asn 194 → Lys 194Мутация в G SPBNGAK вызывала сдвиг порога pH для слияния мембран в сторону более высокого pH, подтверждая гипотезу о том, что более высокий порог pH для слияния мембран связан с увеличением распространения вируса. [41]

Исследования транснейрональных индикаторов инфекции RV у крыс [42] и макак-резусов [43] показали, что вирус бешенства мигрирует исключительно в ретроградном направлении в аксонах. Хотя некоторые белки RV вовлечены в механизмы нейронального транспорта, G RV, по-видимому, играет преобладающую роль в транснейрональном распространении инфекции RV. Например, в то время как периферическое инфицирование вирусом инфекционной анемии лошадей (EIAV), псевдотипированным RV G, приводит к переносу вируса в спинной мозг, тот же EIAV, псевдотипированный вирусом G везикулярного стоматита, не смог проникнуть в нервную систему. [44] Кроме того, обнаружено, что вирусное распространение ERA G Arg 333 → Gln 333мутант в ЦНС сильно редуцирован по сравнению с мутантом дикого типа, также указывает на функцию интактного RV G в транс-синаптическом распространении. Однако наиболее убедительные доказательства важной роли RV G в транс-синаптическом транспорте получены от внутричерепной инфекции мышей рекомбинантным вирусом с дефицитом G RV, что показало, что инфекция оставалась ограниченной нейронами в месте инокуляции без каких-либо признаков заражения. распространяется на вторичные нейроны. [45] Однако вполне вероятно, что в дополнение к RV G, RV M также играет роль в распространении вируса и, следовательно, в транссинаптическом транспорте. В этом отношении было показано, что распространение химерного варианта SN-BMBG RV, который содержит как M, так и G из высокопатогенного SB, было значительно выше, чем распространение химерного варианта SN-BG или SN-BM, которые содержат G и M из SB, соответственно, предполагая, что оптимальное взаимодействие M с G может играть важную роль в распространении вируса от клетки к клетке. [46] Поскольку RV M поддерживает почкование вируса, [47] вероятно, что более эффективное распространение химерного варианта RV SN-BMBG обусловлено оптимальным почкованием вируса на постсинаптической мембране.

Недавние исследования показали, что взаимодействие между RV P и легкой цепью dynein связывает RNP RV с транспортной системой клетки-хозяина, тем самым облегчая ретроградный транспорт аксонального вируса. [48], [49] Однако периферическое инфицирование взрослых мышей показало, что удаление связывающего домена LC8 из RV P не предотвращает проникновение вируса в ЦНС, что позволяет предположить, что белок RV не принимает непосредственного участия в ретроградном аксональном распространении RV. [50]

• Вирусные элементы, контролирующие репликацию вируса

В отличие от многих других вирусов, таких как вирус гриппа, патогенность RV обратно пропорциональна скорости синтеза вирусной РНК и продукции инфекционных вирусных частиц. Сравнение уровней вирусной мРНК и геномной РНК, продуцируемой различными химерными вирусами, предполагает, что транскрипция и репликация вирусной РНК регулируются несколькими факторами, включая RV M, который был идентифицирован как транс-действующий фактор, который опосредует переключение с начальных высоких уровней От синтеза мРНК до синтеза геномной РНК. [51] Более того, M всех рабдовирусов способен отключать экспрессию вирусных генов путем связывания с RNP, что приводит к образованию сильно конденсированной скелетоподобной структуры, которая неспособна поддерживать синтез РНК.

Для идентификации других вирусных элементов, которые контролируют патогенность путем регулирования репликации вируса, 5'-концевые последовательности высокопатогенного штамма SB были поэтапно заменены последовательностями сильно аттенуированного вакцинного штамма SN, в результате чего были получены рекомбинантные вирусы SB2 (концевая последовательность [ TS] + L), SB3 (TS + L + псевдоген [Ψ]), SB4 (TS + L + Ψ + G) и SB5 (TS + L + Ψ + G + M). Внутримышечная инфекция родительскими вирусами SB и SN и химерными RV SB2, SB3, SB4 и SB5 выявила самые высокие уровни смертности у мышей, инфицированных SB, и отсутствие заболеваемости или смертности у мышей, инфицированных SN. Замена TS, L и в SB соответствующими элементами из SN привела к умеренному снижению заболеваемости и смертности, а дополнительный обмен G или G плюс M сильно снизил или полностью исключил патогенность вируса.

Фенотипическая характеристика этих дикого типа и химерных RV в культуре ткани показала, что патогенность конкретного RV обратно коррелирует с его способностью реплицироваться в нейрональных клетках. Хотя SB реплицировался на уровнях почти в 1000 раз ниже, чем SN, а замена TS, L и в SB на уровни SN мало влияла на кинетику роста вируса, дополнительная замена G или G плюс M SB соответствующими генами SN привела к 1-логарифмическому увеличению продукции вируса, предполагая, что кинетика репликации вирусной РНК, а также продукция вирусных частиц в значительной степени контролируются RV. Белок G. Этот вывод подтверждается данными, полученными с вариантами G RV, которые отличаются одной аминокислотой в их G-белках. Патогенный вариант вируса бешенства SPBNGAK 194 продуцировал титр вируса в клетках NA, который был на 1 логарифм ниже, чем титр, продуцируемый непатогенным вариантом SPBNGAN 194, и анализ ПЦР в реальном времени показал, что скорость транскрипции и репликации вирусной РНК в инфицированных клетках NA с SPBNGAK в 5 и 10 раз выше, чем в клетках NA, инфицированных SPBNGAK. [52] Дополнительные доказательства обратной корреляции между патогенностью и скоростью синтеза вирусной РНК и продукции вирусных частиц были получены от мышей, инфицированных химерными рекомбинантными вирусами, у которых гены G и M аттенуированного штамма SN были заменены на гены высокопатогенного штамма SB. Эти эксперименты выявили значительное повышение патогенности родительского штамма SN, несущего RV G, от патогенного штамма SB. Патогенность еще больше увеличивалась, когда и G, и M из SB были введены в SN.

Замена G или M или обоих в SN соответствующими генами из SB была связана со значительным снижением скорости продукции вирусных частиц, а также скорости синтеза вирусной РНК. Эти данные показывают, что как G, так и M играют важную роль в патогенезе RV, регулируя репликацию вируса. Обнаружение того, что замена G или G плюс M в SN на G или G плюс M SB приводит к умеренному или сильному снижению транскрипции и репликации вирусной РНК, соответственно, в то время как замена только M в SN на SB M приводит к в сильном увеличении транскрипции и репликации вирусной РНК, это указывает на то, что RV G также выполняет важную регуляторную функцию в транскрипции / репликации вирусной РНК либо отдельно, либо через взаимодействие с белком М. Механизм, с помощью которого ген RV G контролирует синтез вирусной РНК, неизвестен. Определенные нуклеотидные последовательности в генах RV G, такие как те, которые включают кодоны для Arg333 и Lys 194 были идентифицированы как мишени для клеточных miRNA. Было показано, что распознавание мишени клеточными miRNA может приводить к положительной или отрицательной регуляции репликации вируса. [53] Замены Arg 333 → Glu 333 или Lys 194 → Ser 194 в последовательности гена RV G приводит к отмене целевых последовательностей для miRNA, что, в свою очередь, связано со значительным увеличением скорости синтеза вирусной РНК [Faber M, Thomas Jefferson University, PA, USA, Unpublished Data], что позволяет предположить, что хозяин клеточные miRNA также играют важную роль в регуляции репликации RV, как это было показано для других РНК-вирусов, включая вирус везикулярного стоматита и HCV. [54], [55]

Регуляция вирусной репликации, по-видимому, является одним из важных механизмов, участвующих в патогенезе RV. Чтобы избежать иммунного ответа и сохранить целостность нейронной сети, патогенные штаммы RV, но не аттенуированные штаммы, могут регулировать скорость своего роста. Более низкий уровень репликации, вероятно, приносит пользу патогенным штаммам RV, сохраняя структуру нейронов, которые используются этими вирусами для достижения ЦНС. Другое объяснение более низкой скорости репликации патогенных RV заключается в том, что для того, чтобы избежать раннего обнаружения иммунной системой хозяина, вирус поддерживает минимальные уровни экспрессии своих антигенов.

Связь между экспрессией G RV, апоптозом и патогенностью

Хорошо известно, что штаммы уличных вирусов бешенства, которые являются значительно более патогенными, чем штаммы, адаптированные к культуре тканей, экспрессируют очень ограниченные уровни G и не вызывают апоптоз до конца инфекционного цикла, что позволяет предположить, что патогенность конкретного штамма вируса имеет обратную корреляцию. с экспрессией RV G и способностью вызывать апоптоз. [56] Прямые доказательства корреляции между уровнем экспрессии G и степенью апоптоза были получены с рекомбинантным RV SPBNGA-GA, который нес два идентичных G-гена и сверхэкспрессировал RV G. [57] Морфологические исследования культур нейронов, инфицированных этим рекомбинантным RV, показали, что гибель клеток значительно увеличивалась параллельно со сверхэкспрессией G RV и что апоптоз является основным механизмом, участвующим в G-опосредованной гибели RV. В частности, снижение окрашивания F-актина после заражения SPBNGA-GA согласуется с вызванной апоптозом деполимеризацией актиновых филаментов. Кроме того, количество TUNEL-положительных ядер в нейронах, инфицированных SPBNGA-GA, значительно увеличилось по сравнению с количеством в неинфицированных и инфицированных SPBNGA нейронах. Однако механизм, с помощью которого ген RV G опосредует процесс передачи сигналов апоптоза, остается в значительной степени неизвестным. Было высказано предположение, что экспрессия RV G, превышающая определенный порог, серьезно нарушает клеточную мембрану. Весьма вероятно, что апоптотические клетки не очищаются быстро в ЦНС и поэтому подвергаются вторичному некрозу. [58] С другой стороны, инфекция RV и, в частности, сверхэкспрессия G-белка RV может привести к пироптозу, пути гибели клеток, подобному апоптозу, который, в отличие от апоптоза, включает активацию каспазы 1 и тем самым приводит к некрозу. [59] Степень некроза или пироптоза, вызванного инфекцией правого желудочка, вероятно, играет решающую роль в индукции противовирусного иммунитета. В то время как апоптотические клетки поддерживают целостность своей мембраны и не стимулируют врожденный иммунный ответ, некротические клетки становятся проницаемыми и выделяют эндогенные адъюванты, которые могут запускать устойчивый врожденный иммунный ответ. [60]

Поскольку уровень апоптоза / некроза коррелирует с иммуногенностью RV, было высказано предположение, что иммуностимулирующий эффект апоптотических / некротических клеток, скорее всего, способствует генерации защитного иммунного ответа. Следовательно, регуляция экспрессии RV G очень вероятно является важным фактором в патогенезе бешенства, поскольку она обеспечивает средства для выживания и распространения патогенных вариантов RV в нервной системе, не вызывая явного повреждения нейронов и вызывая защитный иммунный ответ, который помешает заражению.

Экспрессия RV G может регулироваться на уровне синтеза РНК, посттрансляционном уровне или на обоих уровнях. Было показано, что уровни RV G, экспрессируемые различными химерными вариантами RV, отражаются скоростью синтеза вирусной РНК, что указывает на то, что дифференциальная регуляция экспрессии RV G этими вариантами является результатом вариаций в скорости транскрипции вирусного вируса. мРНК. Как и в случае скорости транскрипции вирусной РНК, количество RV G, экспрессируемое этими вариантами, обратно коррелирует с патогенностью вируса. С другой стороны, инфицирование первичных культур нейронов менее патогенным вариантом RV CVS-B2c привело к четырехкратному повышению уровня G-белка, чем инфицирование высокопатогенным вариантом CVS-N2c, несмотря на синтез сопоставимых уровней G-мРНК при обеих инфекциях. Эксперименты Pulse-chase показали, что более высокие уровни G-белка в нейронах, инфицированных CVS-B2c, были в значительной степени результатом более низкой скорости деградации G-белка CVS-B2c по сравнению с G-белком CVS-N2c. Однако механизм, который приводит к более быстрой протеолитической деградации белка CVS-N2c G, требует выяснения.