Лабораторная диагностика туберкулеза

Клинический анализ крови

У больных туберкулёзом изменения в общем анализе крови не патогномоничны. При ограниченных и малоактивных формах туберкулёза характерна гипохромия эритроцитов при нормальном их количестве. При массивных инфильтратах или казеозной пневмонии, при распространённом казеозном лимфадените, специфическом поражении кишечника, а также при больших лёгочных или послеоперационных кровотечениях отмечают эритропению и микроцитоз, олигохромазию, полихромазию. Макроцитоз, а тем более пойкилоцитоз встречают значительно реже, обычно при выраженной анемии. Количество ретикулоцитов при компенсированной стадии туберкулёза колеблется от 0.1 до 0.6%, при субкомпенсированной - от 0,6 до 1,0%, а для декомпенсированной характерен 1% ретикулоцитов.

При туберкулёзе в части случаев может отмечаться умеренный лейкоцитоз (до 15 тыс. лейкоцитов), реже лейкопения, которую встречают в 2-7% случаев у больных с ограниченными и легко протекающими формами процесса и у 12,5% - при деструктивном и прогрессирующем туберкулёзе лёгких.

Наиболее часто сдвиги возникают в лейкоцитарной формуле. Отмечают как относительный, так и абсолютный нейтрофилёз, умеренный сдвиг лейкоцитарной формулы влево до промиелоцитов. Миелоциты очень редко встречают в случае неосложнённого туберкулёза. Повышение числа нейтрофилов с патологической зернистостью в гемограмме больного туберкулёзом всегда указывает на длительность процесса: у больных с тяжёлым туберкулёзом почти все нейтрофилы содержат патологическую зернистость. При затихании туберкулёзной вспышки ядерный сдвиг сравнительно быстро приходит к норме. Патологическая зернистость нейтрофилов обычно сохраняется дольше других изменений гемограммы.

Содержание эозинофилов в периферической крови колеблется также в зависимости от фазы процесса и аллергического состояния организма. Их количество уменьшается вплоть до анэозинофилии при тяжёлых и затянувшихся вспышках болезни и, наоборот, увеличивается при рассасывании инфильтратов и плеврального выпота, а также при ранних формах первичного туберкулёза.

Большинство форм первичного туберкулёза сопровождается лимфопенией, которую иногда наблюдают в течение ряда лег даже после рубцевания специфических изменений. Вторичный туберкулёз в фазе обострения в зависимости от тяжести процесса может сопровождаться или нормальным числом лимфоцитов, или лимфопенией.

Среди тестов для оценки туберкулёзного процесса особое место занимает определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ), имеющее значение при оценке течения туберкулёзного процесса и выявления его активных форм. Увеличение СОЭ указывает на наличие патологического процесса (инфекционно-воспалительного, гнойного, септического, гемобластоза, лимфогранулематоза и др.) и служит показателем его тяжести, однако нормальные показатели СОЭ не всегда свидетельствуют об отсутствии патологии. Ускорению оседания эритроцитов способствуют увеличение содержания в крови глобулинов, фибриногена, холестерина и уменьшение вязкости крови. Замедление оседания эритроцитов характерно для состояний, сопровождающихся гемоконцентрацией, увеличением содержания альбуминов и желчных кислот.

Гемограмма у больных туберкулёзом изменяется в процессе лечения. Гематологические сдвиги исчезают тем быстрее, чем успешнее терапевтическое вмешательство. Вместе с тем следует иметь в виду воздействие на гемопоэз различных антибактериальных препаратов. Они нередко вызывают эозинофилию, в отдельных случаях - лейкоцитоз, а чаще лейкопению вплоть до агранулоцитоза и лимфоидно-ретикулярной реакции. Систематический гематологический контроль и правильный анализ полученных данных имеют существенное значение для оценки клинического состояния больного, динамики процесса и эффективности применяемого лечения.

[5], [6], [7], [8], [9],

Клинический анализ мочи

При туберкулёзе мочевой системы исследование мочи является основным лабораторным методом диагностики. Можно наблюдать лейкоцитурию, эритроцитурию, протеинурию, гипоизостенурию, туберкулёзную микобактериурию, неспецифическую бактериурию.

Лейкоцитурия - самый частый симптом туберкулёза мочевой системы до проведения специфической химиотерапии и отсутствует лишь в исключительных случаях, например при полной облитерации просвета мочеточника. Проба Нечипоренко (определение числа лейкоцитов в 1 мл мочи) помогает более объективно оценить степень лейкоцитурии при нефротуберкулёзе, а в ряде случаев и выявить её при нормальном общем анализе мочи. Однако надо учитывать, что лейкоцитоурия может быть при острых и хронических пиелонефритах, цистите, уретритах, камнях в почках и мочеточниках.

Эритроцитурию. как и лейкоцитурию. считают одним из наиболее частых лабораторных признаков туберкулёза мочеполовой системы. Частота гематурии зависит от распространённости процесса, она нарастает по мере развития деструктивного туберкулёзного процесса в почке. Эритроцитурия без лейкоцитурии более характерна для ранних стадий туберкулёза почек. Гематурия, преобладающая над лейкоцитурией, - важный довод в пользу туберкулёза почек при его дифференциации с неспецифическим пиелонефритом.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Биохимический анализ крови

При туберкулёзе изменения в некоторых биохимических показателях зависят прежде всего от фазы процесса, осложнений и различных сопутствующих заболеваний. У больных с неактивным туберкулёзом лёгких и других органов общий белок и белковые фракции сыворотки крови не изменены и определяют их нормальное содержание.

При острых формах заболевания, а также при обострении и прогрессировании хронических форм туберкулёза уменьшается альбумин-глобулиновый коэффициент.

Существенное значение в оценке функционального состояния и органических повреждений печени при туберкулёзе и его осложнениях имеет определение в сыворотке крови прямого и общего билирубина, аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ). Динамическое определение уровня аминотрансфераз. билирубина при лечении больных туберкулёзом, особенно при тяжёлых его формах, - обязательный компонент биохимического обследования больных туберкулёзом и проводится ежемесячно.

Оценка функционального состояния почек включает в себя определение креатинина сыворотки крови и расчёт скорости клубочковой фильтрации по формуле Кокрофта-Голта. Расчёт скорости клубочковой фильтрации с использованием пробы Реберга даёт менее точные результаты.

Основная цель динамических биохимических исследований больных туберкулёзом - контроль за течением процесса, своевременное выявление побочного действия лекарств и адекватная коррекция возникающих нарушений гомеостаза.

[17], [18], [19]

Применение биохимических методов исследования при внелёгочном туберкулёзе

Наиболее информативным показателем считают содержание туберкулостеариновой кислоты в биологических жидкостях, однако её определение сопряжено с техническими трудностями (необходимость использования газовой хроматографии и масс-спектрометрии).

Перспективно измерение активности аденозиндезаминазы - фермента, определяемого в жидкостях: синовиальной, перикардиальной, асцитической или спинномозговой. Основные продуценты аденозиндезаминазы - лимфоциты и моноциты. Определение активности аденозиндезаминазы в биологических жидкостях облегчает диагностику туберкулёзного синовита, туберкулёза лимфатических узлов, туберкулёзного менингита, туберкулёзного серозита.

Некоторые биохимические показатели ввиду их неспецифичности определяются лишь в биологических жидкостях, приближенных к очагу поражения. Измеряют уровень показателей в ответ на подкожное или внутрикожное введение туберкулина (обычно до введения и через 48 и 72 ч после него). После этого рассчитывается степень прироста уровня маркёра (в %) по отношению к исходному уровню.

Оптимально определение в моче активности органоспецифического фермента трансамидиназы, появление которого отмечают при поражении почек различной природы. Исследование трансамидиназы оправдано только в условиях подкожного введения туберкулина с целью обострения местного воспалительного процесса. Определяют активность трансамидиназы в моче исходно и через 24-72 ч после введения 50 ТЕ туберкулина. Увеличение ферментурии в 2 раза и более позволяет в 82% случаев дифференцировать активный туберкулёз почек от обострения хронического пиелонефрита.

При туберкулёзе женских половых органов определяют концентрации гаптоглобина и малонового диальдегида в крови в условиях провокационного туберкулинового теста. Подкожно вводят туберкулин в дозе 50 ТЕ и через 72 ч выполняют повторное биохимическое исследование. В случае туберкулёзной этиологии степень прироста уровня гаптоглобина составляет не менее 28%, а уровня малонового диальдеги-да - 39% и более. Также используют определение активности аденозиндезаминазы в перитонеальной жидкости, получаемой из дугласова пространства. Пунктат исследуют повторно через 72 ч после внутрикожного введение туберкулина в дозах 0.1 ТЕ и 0.01 ТЕ в область проекции внутренних половых органов на переднюю брюшную стенку. В пользу туберкулёзного процесса свидетельствует увеличение активности аденозиндезаминазы на 10% и более по сравнению с исходной.

При поражении глаз исследуют очаговую реакцию, возникающую в глазу в ответ на антигенную стимуляцию. При этом нежелательно развитие резко выраженного ответа, сопровождающегося снижением зрительных функций. Поскольку оценка минимальных очаговых реакций нередко затруднена, для объективизации заключения рекомендуют ориентироваться параллельно и на степень прироста в сыворотке крови гаптоглобина или аденозиндезаминазы.

Все биохимические исследования должны проводиться в комплексе с другими методами.

[20], [21], [22], [23],

Исследование свертывающей системы крови

Актуальность исследования состояния системы свёртывания крови во фтизиатрии обусловлена наличием у ряда больных туберкулёзом лёгких кровохарканий или лёгочных кровотечений, а также гемокоагуляционными осложнениями при хирургическом лечении туберкулёза. Кроме того, закономерно сопутствующая туберкулёзу латентно протекающая внутрисосудистая гемокоагуляция оказывает влияние на течение заболевания и эффективность химиотерапии.

У больных туберкулёзом лёгких с преобладанием экссудативного компонента воспаления наблюдают снижение антикоагулянтной активности крови. У больных с малой распространённостью специфического поражения в лёгких с преобладанием продуктивного компонента воспаления внутрисосудистая гемокоагуляция выражена незначительно. У больных туберкулёзом лёгких с кровохарканьями и лёгочными кровотечениями состояние системы свёртывания крови различно: у больных с малой кровопотерей на высоте гемоптоэ или непосредственно после его прекращения наблюдают резкое повышение свёртывающей способности крови за счёт выраженной интенсификации процессов тромбинообразования при сохранении повышенной «структурной» свёртываемости. У больных с массивной кровопотерей наблюдают понижение свёртывающего потенциала за счёт понижения концентрации фибриногена. активности фактора XIII, количества тромбоцитов. На этапе хирургического лечения у больных с ограниченными формами туберкулёза лёгких существенных нарушений с системе гомеостаза не происходит. У больных с распространёнными процессами при выполнении им пневмон- или плевропневмонэктомии часто развивается ДВС-синдром, который может приобретать формы «второй болезни».

Для контроля за состоянием свёртывающей системы крови у больных туберкулёзом лёгких необходимо проводить определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), фибриногена, тромбинового времени, протромбинового индекса, а также времени кровотечения и времени свёртывания крови.

[24], [25], [26], [27], [28]

Гормональные исследования

Современные экспериментальные и клинические наблюдения свидетельствуют о наличии изменений гормонального статуса при специфическом туберкулёзном воспалении лёгких. Доказано, что коррекция дисфункции гипофизарно-надпочечниковой, гипофизарно-тиреоидной систем и функции поджелудочной железы в совокупности с противотуберкулёзной терапией способствуют активации процессов фиброгенеза и репарации в очаге специфического воспаления.

О функциональном состоянии гипофизарно-тиреоидной системы судят по содержанию в сыворотке крови трийодтиронина (Т₃), тироксина (T₄), тиреотропного гормона гипофиза (ТТГ). Установлено, что субклинический гипотиреоз выявляют у 38-45% больных туберкулёзом лёгких, и наиболее часто его диагностируют при диссеминированной и фиброзно-кавернозной формах процесса. При этих же формах наиболее резко снижены уровни как Т₃,так и Т₄, и наступает дисбаланс этих гормонов в виде повышения соотношения Т₄/Т_з.

Функцию коры надпочечников оценивают по уровню кортизола в сыворотке крови, а инкреторную функцию поджелудочной железы - по концентрации иммуно-реактивного инсулина. В острую фазу инфекционного заболевания возрастает потребность в эндогенном кортизоле и инсулине. Гиперинсулинемия свидетельствует также об инсулинрезистентности тканей организма, что характерно для любого активного воспалительного процесса, в частности специфического. Определение глюкокортико-идной функции надпочечников при активном туберкулёзе лёгких позволяет выявить наличие гиперкортицизма у большинства больных. Нормальные показатели концентрации кортизола крови у пациента с инфекционным воспалением в острый период следует расценивать как относительную недостаточность глюкокортикоидной функции коры надпочечников, что может послужить основанием к проведению заместительной терапии адекватными дозами глюкокортикоидов.

Почти у трети больных туберкулёзом лёгких можно установить, что уровень инсу-линемии у них достаточно низок и приближается к нижней границе нормы, в то время как у 13-20% наблюдают значительный гиперинсулинизм. Как относительный гипо- так и гиперинсулинизм являются высокими факторами риска к развитию нарушений углеводного обмена различной степени выраженности. Эти изменения в функциональной активности В-клеток поджелудочной железы требуют регулярного контроля гликемии у больных туберкулёзом и своевременной профилактики сахарного диабета. К тому же. это служит дополнительным обоснованием целесообразности применения физиологических доз инсулина в комплексной терапии туберкулёза.

В целом снижение уровней тиреоидных гормонов, их дисбаланс, гиперкортизолемия и гиперинсулинизм наибольшей степени достигают у больных с тяжёлым течением туберкулёзного процесса, с обширными поражениями лёгких и выраженными симптомами туберкулёзной интоксикации.

Микробиологическая диагностика туберкулеза

Микробиологические исследования необходимы при выявлении больных туберкулёзом, верификации диагноза, контроле и коррекции химиотерапии, оценке исходов лечения, другими словами, с момента регистрации больного туберкулёзом до снятия его с учёта.

Все эпидемиологические программы и проекты основаны на оценке количества бактериовыделителей, что невозможно сделать без использования лабораторных методик выявления микобактерий туберкулёза. При обследовании по обращаемости так называемого неорганизованного населения процент бактериовыделителей достигает 70 и более, что делает лабораторные методы достаточно эффективным средством выявления больных туберкулёзом среди данной группы населения.

Традиционные микробиологические методы диагностики туберкулёза - бактериоскопическое и культуральное исследования. Современными методами считают культивирование микобактерий туберкулёза в автоматизированных системах, постановку ПЦР. Однако все эти методы обязательно сочетают с классическими бактериологическими методами.

Сбор диагностического материала

Эффективность лабораторных исследований в значительной степени зависит от качества диагностического материала. Соблюдение правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала и точное выполнение алгоритма обследования больных непосредственно влияет на результат и обеспечивает биологическую безопасность.

Для исследования на туберкулёз используют разнообразный материал. В связи с тем что туберкулёз лёгких- самая распространённая форма туберкулёзного поражения, основным материалом для исследования считают мокроту и другие виды отделяемого трахеобронхиального дерева: отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозоль-ингаляций: промывные воды бронхов; бронхоальвеолярные смывы; материал, получаемый при бронхоскопии, транстрахеальной и внутрилёгочной биопсии: аспират из бронхов, ларингеальные мазки, экссудаты, мазки из ран и др.

Эффективность исследований возрастает, если проводят контролируемый сбор материала от больного. Для этого выделяют специально оборудованную комнату или закупают специальные кабины. Сбор материала - опасная процедура, поэтому собирать материал для исследования нужно, соблюдая правила инфекционной безопасности.

Материал для исследования на микобактерии туберкулёза собирают в стерильные флаконы с плотно завинчивающимися крышками, чтобы предотвратить заражение окружающей среды и предохранить собранный материал от загрязнения.

Флаконы для сбора диагностического материала должны отвечать следующим требованиям:

• должны быть изготовлены из ударостойкого материала;
• должны легко расплавляться при автоклавировании;
• быть достаточного объёма (40-50 мл):
• иметь широкое отверстие для сбора мокроты (диаметр не менее 30 мм);
• быть удобными в обращении, прозрачными или полупрозрачными, чтобы можно было оценить количество и качество собранной пробы, не открывая крышку.

Для получения оптимальных результатов исследования необходимо соблюдать следующие условия:

• сбор материала проводить до начала химиотерапии;
• материал для исследования необходимо собирать до утреннего приёма пиши и лекарственных препаратов;
• для исследования желательно собрать не менее 3 проб утренней мокроты. Собирают мокроту в течение 3 дней подряд;
• собранный материал необходимо как можно быстрее доставить в лабораторию:
• в случае, когда доставить материал в лабораторию немедленно невозможно, его сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4 °С не более 48 ч;
• при перевозке материала необходимо особенно тщательно следить за целостностью флаконов.

Правильно собранная мокрота имеет слизистый или слизисто-гнойный характер. Оптимальный объём исследуемой порции мокроты составляет 3-5 мл.

Мокроту собирают под надзором медицинского работника. Лицам, ответственным за сбор мокроты, необходимо следить за выполнением определённых правил:

• нужно объяснить больному цели исследования и необходимость откашливать не слюну или носоглоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей. Этого можно добиться в результате продуктивного кашля, возникающего после нескольких (2-3) глубоких вдохов. Нужно также предупредить больного, что он должен предварительно прополоскать рот кипячёной водой, для удаления основной части вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатков пищи, затрудняющих исследование мокроты;
• участвующий в сборе мокроты медицинский работник, помимо халата и шапочки, должен надеть маску, резиновые перчатки и резиновый фартук;
• стоя позади больного, ему рекомендуют держать флакон как можно ближе к губам и сразу же отделять в него мокроту по мере её откашливания, при этом необходимо предусмотреть, чтобы поток воздуха был направлен в сторону от медработника:
• по завершении сбора мокроты медицинский работник должен тщательно закрыть флакон крышкой и оценить количество и качество собранной мокроты. Затем флакон маркируют и помещают в специальный бикс для транспортировки в лабораторию.

Если больной не выделяет мокроту, то накануне вечером и рано утром в день сбора материала нужно дать ему отхаркивающее средство: экстракт корней алтея лекарственного (мукалтин), бромгексин, амброксол и др. - или применить раздражающую ингаляцию, используя оборудование, установленное в комнате для сбора мокроты. Собранный таким образом материал не подлежит консервации и должен быть исследован в день сбора. Во избежание его «выбраковки» в лаборатории в направлении следует сделать специальную отметку.

Если в данном учреждении не проводят микробиологические исследования, собранный диагностический материал должен быть централизованно доставлен в лабораторию при условии обязательного сохранения материала в промежутках между доставками в холодильнике или с применением консервантов. Доставляют материал в лабораторию в транспортировочных ящиках, которые легко можно продезинфицировать. Каждая проба должна быть снабжена соответствующей этикеткой, а вся партия - заполненным сопроводительным бланком.

[29], [30], [31],

Режимы и кратность обследования больных

При первичном, так называемом диагностическом, обследовании больного на туберкулёз необходимо в течение 2 или 3 дней исследовать не менее 3 порций мокроты. собранных под наблюдением медицинского персонала, что повышает результативность микроскопии.

Первичный скрининг туберкулёза должны осуществлять все лечебно-диагностические учреждения системы здравоохранения. В последнее время для повышения эффективности первичного обследования на базе клинико-диагностических лабораторий организованы так называемые центры микроскопии, оснащённые современными микроскопами и оборудованием для обеспечения эпидемической безопасности.

В противотуберкулёзных учреждениях используют схему обследования, предусматривающую не менее чем 3-кратное в течение 3 дней исследование мокроты или другого диагностического материала. В процессе лечения микробиологические исследования проводят регулярно не реже 1 раза в месяц в фазе интенсивной химиотерапии. При переходе к фазе долечивания исследования проводят реже - с интервалом в 2-3 мес, при этом кратность исследования снижают до двух.

Особенности сбора диагностического материала при внелегочном туберкулезе

Особенность патологического материала при внелёгочных формах туберкулёза - малая концентрация микобактерий туберкулёза в нём, что требует более чувствительных методов микробиологического исследования, в первую очередь, методов посева на питательную среду.

При туберкулёзе мочеполовой системы моча - наиболее доступный материал исследования. Забор мочи должен производиться специально обученной медицинской сестрой.

Наружные половые органы обмывают водой с мылом или слабым раствором калия перманганата. Тщательно обрабатывают наружное отверстие мочеиспускательного канала. В стерильный флакон собирают среднюю порцию утренней мочи: у мужчин - естественным путём, у женщин - с помощью катетера. Мочу из почечных лоханок собирают в стерильные пробирки при катетеризации одной или двух почек, в последнем случае - обязательно раздельно из каждой почки. Небольшое количество этой мочи центрифугируют, осадок исследуют.

У мужчин сперму, пунктаты яичек, секрет простаты подвергают центрифугированию для получения осадка. При любой локализации специфического процесса в половой сфере у мужчин массаж предстательной железы может способствовать выделению секрета, содержащего микобактерии туберкулёза.

Менструальную кровь у женщин собирают отсосом или с помощью колпачка Кафки. Полученный материал освобождают от эритроцитов, отмывая его дистиллированной водой с последующим центрифугированием. Осадок исследуют.

Выделения из шеечного канала матки собирают в какую-либо ёмкость или колпачок Кафки, то есть желательно накопить 1-2 мл патологического материала.

Материал, полученный при оперативных вмешательствах на почках, половых органах. при биопсиях, соскобах с эндометрия, гомогенизируют. Для этого его помещают в стерильную ступку и тщательно измельчают стерильными ножницами. К полученной взвеси добавляют стерильный речной песок в количестве, равном её массе, затем доливают 0,5-1.0 мл изотонического раствора натрия хлорида и всё растирают до образования кашицеобразной массы с добавлением изотонического раствора натрия хлорида (4-5 мл). Затем массе дают отстояться в течение 1-1,5 мин, надосадочную жидкость исследуют.

Туберкулёз костей и суставов. Пунктат (гной натёчных абсцессов), полученный стерильным шприцем, помещают в стерильную посуду и сразу доставляют в лабораторию. Стерильной пипеткой, предварительно смоченной стерильным изотоническим раствором натрия хлорида, забирают 2-5 мл гноя, переносят его во флакон с бусами и добавляют ещё 2-3 мл изотонического раствора натрия хлорида. Флакон закрывают пробкой и встряхивают в шуттель-аппарате в течение 8-10 мин. Гомогенизированную взвесь исследуют.

При свищевых формах костно-суставного туберкулёза берут гной из свища. Обильное отделяемое собирают непосредственно в пробирку. В случаях скудного выделения гноя промывают свищевой ход стерильным изотоническим раствором натрия хлорида, а промывные воды, собранные в пробирку, или кусочек тампона, пропитанного гноем, отправляют на исследование.

Хирургический материал, полученный при оперативных вмешательствах на костях и суставах, может состоять из гнойно-некротических масс, грануляций, рубцовой, костной ткани, ткани синовиальных оболочек и других субстратов. Его обработку производят, как при туберкулёзе почек.

Микробиологическое исследование синовиальной жидкости в 3% растворе натрия цитрата (в соотношении 1:1) для предупреждения свёртывания проводят непосредственно после пункции.

Туберкулёз лимфатических узлов. Гной, извлечённый во время пункции лимфатических узлов, исследуют так же. как гной натёчных абсцессов. Ткани лимфатических узлов, полученные при оперативных вмешательствах, биопсиях, исследуют, как при других формах туберкулёза.

Исследование каловых масс на микобактерии туберкулёза производят чрезвычайно редко в связи с практически полным отсутствием положительных результатов.

[32], [33], [34], [35], [36],

Микроскопия микобактерий

Микроскопия мокроты - сравнительно быстрый, простой и недорогой метод, который должен быть использован во всех случаях при подозрении на туберкулёз. Кроме того, это исследование проводят для оценки эффективности химиотерапии и для констатации выздоровления или неудачного исхода лечения при отсутствии результатов культурального исследования.

Используют 2 метода микроскопического исследования:

• метод прямой микроскопии, когда мазок готовят непосредственно из диагностического материала;
• метод микроскопии осадка, подготовленного из обработанного деконтаминанта-ми материала для культурального исследования.

Первый метод используют в тех лабораториях, где проводят только микроскопические исследования (клинико-диагностические лаборатории общей лечебной сети).

Лучшие результаты микроскопического исследования получают при концентрировании диагностического материала (например, центрифугированием).

Чтобы обнаружить микобактерии туберкулёза с вероятностью 50% при проведении микроскопии, 1 мл мокроты должен содержать более 5000 микробных клеток. Мокрота пациентов с лёгочными формами туберкулёза обычно содержит значительное количество кислотоустойчивых бактерий, что позволяет уверенно выявить их при бактериоскопии. Диагностическую чувствительность этого метода можно повысить, если исследовать несколько образцов мокроты от одного пациента. Отрицательный результат бактериоскопического исследования не исключает диагноза туберкулёза, поскольку мокрота некоторых пациентов содержит меньше микобактерий, чем можно выявить с помощью микроскопии. Плохая подготовка мазков мокроты также может быть причиной отрицательного результата бактериоскопического исследования.

Наиболее распространённый метод для выявления кислотоустойчивых микобактерий в мазке - окраска по Цилю-Нельсену. Метод основан на проникновении карболового фуксина в микробную клетку через мембрану, включающую в себя восково-липидный слой, при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия фенола. Последующее обесцвечивание мазка 25% раствором серной кислоты или 3% солянокислым спиртом приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3% раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы - в голубой.

Для исследования мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (90- или 100-кратное увеличение) и окуляром с 7- или 10-кратным увеличением. Исследуют 100 полей зрения, что достаточно для выявления в мазке единичных микобактерий. В том случае, если результат такого исследования отрицательный, для подтверждения рекомендуют просмотреть еще 200 полей зрения. Регистрируют результаты, указывая количество обнаруженных кислотоустойчивых микобактерий (КУМ).

Помимо данной методики, применяют окраску флюорохромами для люминесцентной микроскопии, что позволяет достичь наилучших результатов. Применение этого метода повышает эффективность микроскопии на 10-15%. При обработке микобак-терий люминесцентными красителями (аурамин, родамин и др.) эти вещества также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При облучении окрашенных клеток возбуждающим источником света (определённый спектр ультрафиолетового излучения) они начинают светиться оранжевым или ярко-красным светом на черном или тёмно-зелёном фоне. В связи с высокой яркостью и контрастностью видимого изображения можно снизить общее увеличение микроскопа в 4-10 раз, чем расширяется поле зрения и уменьшается время просмотра препарата. Наряду с этим за счёт значительно большей глубины резкости можно повысить комфортность исследования.

При использовании флюоресцентной микроскопии на просмотр той же площади мазка затрачивают значительно меньше времени, чем при световой микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену. Если за рабочий день микроскопист просматривает примерно 20-25 таких мазков, то с помощью флюоресцентной микроскопии он может исследовать за то же время более 60-80 образцов. Опытные микроскопист знают, что окраска клеток смесью аурамина и родамина является в некотором роде специфической для кислотоустойчивых микобактерий, которые в этом случае имеют вид золотистых палочек. Сапрофиты окрашиваются в зеленоватый цвет.

Другое важное преимущество метода флюоресцентной микроскопии - возможность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда неблагоприятных факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоусотойчивости и не выявляющиеся в связи с этим при окраске по Цилю-Нельсену.

К недостаткам метода флюоресцентной микроскопии относят сравнительно высокую стоимость микроскопа и его эксплуатации. Однако в централизованных или других крупных лабораториях, где нагрузка превышает норму 3 лаборантов, работающих с тремя обычными микроскопами, дешевле использовать вместо этого один флюоресцентный микроскоп.

Бактериоскопические методы обладают довольно высокой специфичностью (89-100%). Около 97% положительных результатов, полученных любым методом микроскопии, однозначно подтверждаются результатами посева.

Необходимо отметить, что при микроскопическом исследовании мазка патологического материала нельзя определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых микобактерий. Метод микроскопии позволяет дать заключение лишь о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микроорганизмов, что объясняется существованием в природе большого числа морфологически сходных с микобактериями туберкулёзного комплекса нетуберкулёзных кислотоустойчивых микроорганизмов.

Оценку результатов микроскопии производят в полуколичественных единицах.

Для того чтобы можно было сравнивать результаты различных методов микроскопии, вводят эмпирические коэффициенты. Например, чтобы сопоставить результаты исследования мазка, окрашенного флюоресцентными красителями, с данными исследования световой микроскопии (1000-кратное увеличение), необходимо разделить количество кислотоустойчивых микобактерий, обнаруженных с помощью люминесцентного микроскопа, на соответствующий коэффициент при 250-кратном увеличении микроскопа - на 10, при 450-кратном - на 4, при 630-кратном - на 2.

Особенности микроскопии при внелегочном туберкулезе

Осуществляют прямую микроскопию, а также микроскопию мазков, приготовленных после обогащения с последующей окраской по Цилю-Нельсену или люминесцентными красителями. Прямая микроскопия мазков малоэффективна в связи с низкой концентрацией микобактерий в материале, а потому рациональнее использовать методы обогащения. Наиболее эффективно центрифугирование. Если биологический материал вязкий, применяют центрифугирование с одновременной гомогенизацией и разжижением материала, которое проводят с помощью высокооборотных центрифуг с силой центрифугирования 3000 g и растворов гипохлорита. Другие методы обогащения, например микрофлотацию, в настоящее время не используют из-за образования биологически опасных аэрозолей.

[37], [38],

Культуральный метод диагностики туберкулеза

Метод посева, или культуральный метод, отличается большей чувствительностью, чем микроскопия мазков, и имеет перед последним ряд преимуществ. Он позволяет обнаруживать несколько десятков жизнеспособных микобактерий в исследуемом материале и имеет большую диагностическую ценность. Это особенно важно при исследовании материала от впервые выявленных или леченных больных, выделяющих небольшое количество микобактерий.

По сравнению с микроскопией, культуральное исследование позволяет увеличить число выявленных больных туберкулёзом более чем на 15-25%, а также верифицировать туберкулёз в более ранних стадиях, когда заболевание ещё хорошо поддаётся лечению. Очень важным преимуществом культурального исследования считают возможность получения культуры возбудителя, которая может быть идентифицирована и изучена в отношении лекарственной чувствительности, вирулентности и других биологических свойств.

К недостаткам методов культивирования следует отнести их длительность (срок ожидания материалов достигает 10 нед). более высокую стоимость, сложность обработки диагностического материала.

Принципы предпосевной обработки диагностического материала

Обычные микробиологические методики не могут быть использованы при проведении исследований на туберкулёз. Это связано с тем. что растут микобактерии туберкулёза очень медленно, а большинство проб клинического материала содержит быстрорастущие гноеродные и гнилостные микроорганизмы, грибы. Их бурный рост на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и не позволяет выделить возбудителя туберкулёза, поэтому перед посевом диагностический материал обязательно подвергают предварительной обработке. Кроме того, микобактерии, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизи, затрудняющей их концентрирование. В связи с этим перед посевом мокроты и других сходных материалов необходимо их разжижение, деконтаминация.

Все детергенты и деконтаминанты обладают более или менее выраженным токсическим действием на микобактерии. В результате обработки может гибнуть до 90% микобактерий. Чтобы сохранить достаточную часть микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущие гноеродные и гнилостные микроорганизмы, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий.

В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные деконтаминанты: для мокроты - раствор гидроксида натрия 4%, растворы трёхзамещённого фосфорнокислого натрия 10%, бензалкониума хлорида тринатрий фосфата, NALC-NaOH (N-ацетил-L-цистеин-гидроксид натрия) с конечной концентрацией NaOH 1%, для мочи и других жидких материалов - раствор серной кислоты 3%, для загрязнённых проб, жиросодержащих материалов - раствор щавелевой кислоты до 5%. Кроме того, в некоторых случаях используют ферменты, поверхностно-активные вещества (детергенты). Применение твина и некоторых других детергентов сопровождается меньшей гибелью микобактериальных клеток (выживают 40-50%). однако использовать их можно только для жидких материалов. Наибольшее распространение в мире получил NALC-NaOH. выпускаемый в наборах. Этот метод позволяет выделять более 85% популяции клеток микобактерий. Деконтаминация тканесодержащих твёрдых материалов труднее, поскольку угадать степень дисперсности материала в процессе гомогенизации сложно. Например, обработка биоптатов лимфатических узлов нередко сопровождается повышенной частотой контаминации посторонней флорой. В этом случае можно использовать 1% этоний.

Негомогенный материал гомогенизируют с помощью стеклянных бус в присутствии деконтаминантов. Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке подвергают только осадок.

Техника посева и инкубации

После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования. Техника посева должна предотвращать кросс-контаминацию диагностического материала.

Для достоверной клинической интерпретации результатов микробиологического исследования необходимо соблюдать следующее правило: микроскопическое и культуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала.

Инокулированные пробирки помещают в термостат при 37 ^oС на 2 сут в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 сут пробирки переводят в вертикальное положение и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред.

Посевы выдерживают в термостате при 37 ^оС в течение 10-12 нед при регулярном еженедельном просмотре. При каждом контрольном просмотре регистрируются следующие параметры:

• срок визуально наблюдаемого со дня посева роста;
• интенсивность роста (число КОЕ);
• загрязнение посева посторонней микробной флорой или грибами (такие пробирки удаляют);
• отсутствие видимого роста. Пробирки оставляют в термостате до следующего просмотра.

Питательные среды

Для культивирования микобактерий используют различные питательные среды; плотные, полужидкие, жидкие. Однако ни одна из известных питательных сред не обладает свойствами, обеспечивающими рост всех микобактериальных клеток. В связи с этим для повышения результативности рекомендуют применять одновременно 2-3 питательные среды разного состава.

В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулёза и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендует среду Левенштейна-Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой рост микобактерий получают на 20-25-й день после посева бактериоскопически положительного материала. Посевы бактериоскопически отрицательного материала требуют более длительного периода инкубации (до 10-12 нед).

В нашей стране широкое распространение получила предложенная Э.Р. Финном яичная среда Финн-II. Она отличается тем, что вместо L-аспарагина в ней используют глутамат натрия, запускающий иные пути синтеза аминокислот микобактерий. Рост появляется на этой среде несколько раньше, а частота выделения микобактерий на 6-8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

Для повышения эффективности бактериологической диагностики внелёгочного туберкулёза целесообразно включать в комплекс питательных сред модифицированные среды Финн-II. Для ускорения роста в питательную среду Финн-II дополнительно вводят натрий тиогликолат 0,05%, снижающий концентрацию кислорода. Для защиты ферментных систем микобактерий от токсичных продуктов перекисного окисления липидов в питательную среду Финн-II вводят антиоксидант α-токоферола ацетат в концентрации 0,001 мкг/мл. Посев диагностического материала производят по стандартной методике.

В противотуберкулёзных лабораториях России используют и другие модификации плотных питательных сред; предложенную Г.Г. Мордовским питательную среду «Новая», разработанные В.А. Аникиным питательные среды А-6 и А-9 и др.

В связи с тем что в процессе химиотерапии происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, часть микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на обычных питательных средах и требует осмотически сбалансированных (полужидких или жидких) питательных сред.

Оценка и учет результатов посева диагностического материала

Некоторые штаммы и виды микобактерий растут медленно, рост может появляться даже к 90-му дню. Число таких культур невелико, но это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 2,5-3 мес.

Вирулентные культуры микобактерий туберкулёза обычно растут на плотных яичных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, слегка пигментированные. На других средах колонии микобактерий туберкулёза могут быть более влажными. После курса химиотерапии или в процессе лечения могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы).

При выделении культур используют комплекс специальных исследований, позволяющих отличить микобактерии туберкулёза от нетуберкулёзных микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

Положительный ответ дают после обязательного микроскопического исследования окрашенного по Цилю-Нельсену мазка из выросших колоний. В случае роста микобактерий в мазках обнаруживают ярко-красные палочки, лежащие одиночно или группами, образующие скопления в виде войлока или кос. В молодых культурах, особенно выделенных от длительно леченных химиопрепаратами больных, микобактерии отличаются выраженным полиморфизмом, вплоть до наличия наряду с палочковидными формами коротких, почти кокковидных или же удлинённых вариантов, напоминающих мицелий грибов.

Интенсивность роста микобактерий обозначают по следующей схеме: (+) - 1-20 КОЕ в пробирке (скудное бактериовыделение); (++) - 20-100 КОЕ в пробирке (умеренное бактериовыделение); (+++) - >100 КОЕ в пробирке (обильное бактериовыделение). При лабораторной диагностике туберкулёза недостаточно дать ответ, ющий, обнаружены ли или нет тем или иным методом микобактерии. иметь детальное представление об объёме и характере микобактериальной популяции, её составе и свойствах. Именно эти данные позволяют правильно интерпретировать состояние процесса, планировать тактику и своевременно корригировать лечение.

В последние годы для ускорения роста микобактерий предложены питательные среды на агаровой основе с различными ростовыми добавками и применением специальной газовой смеси. Для получения роста микобактерий на этих средах при культивировании создают атмосферу с повышенным содержанием углекислого газа (4-7%). С этой целью используют специальные СО₂-инкубаторы. Однако наибольшее развитие получили автоматизированные системы культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960 и MB/Bact.

Одна из таких систем - система MGIT (mycobacteria growth indicating tube), которая относится к разработкам высоких технологий и предназначена для ускоренной бактериологической диагностики туберкулёза и определения чувствительности микобактерий к препаратам первого ряда и некоторым препаратам второго ряда. MGIT ориентирована на использование её в составе прибора ВАСТЕС-960. Культивируют микроорганизмы в специальных пробирках с жидкой питательной средой на основе модифицированной среды Middlebrook-7Н9. Для стимуляции роста микобактерий и подавления роста посторонней микрофлоры используются добавки роста MGIT Growth Supplement и смесь антибактериальных препаратов PANTA.

Регистрацию роста микроорганизмов осуществляют оптически. В её основе лежит флюоресценция, возникающая при потреблении кислорода микобактерия-ми в процессе роста. Кислородзависимый флюорохромный краситель содержится на дне специальной пробирки и покрыт слоем силикона. Размножение микобактерий приводит к уменьшению количества кислорода в пробирке и снижению его концентрации, что вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор ВАСТЕС-960. Интенсивность свечения регистрируют в единицах роста (GU- growth units). Данные роста заносятся в компьютер, где их можно сохранить, автоматически. Компьютерный анализ кривых роста может дать информацию о наличии различных пулов микобактерий, в том числе нетуберкулёзных, а также помогает оценить ростовые свойства микобактерий.

В результате внедрения таких систем время появления роста микобактерий значительно сократилось, составляя в среднем 11 дней на ВАСТЕС-960 и 19 дней на MB/Bact против 33 дней на стандартной плотной питательной среде. Необходимо отметить, что эти системы требуют высокой квалификации персонала. Посев материала на жидкие среды обязательно сопровождают посевом на среду Левенштейна-Йенсена, играющую роль дублёра в тех случаях, когда на других средах микобактерии туберкулёза не дают роста.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Определение лекарственной чувствительности микобактерий

Определение спектра и степени чувствительности микобактерий к противотуберкулёзным препаратам имеет важное клиническое значение, а также для эпидемиологической оценки распространения туберкулёза с лекарственной устойчивостью. Кроме того, мониторинг лекарственной устойчивости позволяет оценивать эффективность противотуберкулёзной программы в целом, являясь интегральным показателем работы всех составляющих противотуберкулёзных мероприятий.

Кратность и сроки определения лекарственной чувствительности:

• до начала лечения однократно для определения стратегии и тактики лечения:
• при изоляции от больного культур из различного материала (мокрота, БАЛ, моча, экссудаты, ликвор и др.) исследуются все выделенные штаммы:
• в конце интенсивной фазы лечения при отсутствии клинико-рентгенологической динамики:
• при необходимости изменения схемы лечения в случае:
  • отсутствия негативации мокроты;
  • повторного выделения культуры после негативации мокроты;
  • резкого увеличения количества КУМ в мазке после первоначального снижения. Хорошо известно, что из материала от больного туберкулёзом выделяют неоднородные по лекарственной чувствительности штаммы микобактерий туберкулёза. Чувствительность штаммов к противотуберкулёзным препаратам может отличаться по спектру препаратов, степени, частоте и скорости появления устойчивости.

Степень лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёза определяют в соответствии с установленными критериями, которые ориентированы на клиническую значимость устойчивости и зависят от противотуберкулёзной активности препарата, его фармакокинетики, концентрации в очаге поражения. величины максимальной терапевтической дозы и прочее.

Определение лекарственной чувствительности микобактерий в настоящее время проводят микробиологическими методами:

• абсолютных концентраций (метод разведений на плотной или жидкой питательных средах),
• пропорций,
• коэффициента резистентности.

Обычно устойчивость проявляется в виде визуально наблюдаемого роста колоний микобактерий туберкулёза, однако существуют методики, индуцирующие рост в ранних стадиях деления клеток микобактерий в виде цветных реакций. Эти методы сокращают время проведения теста с 3-4 до 2 нед.

В качестве унифицированного в России получил распространение рекомендованный Комитетом по химиотерапии ВОЗ метод абсолютных концентраций, который с методической точки зрения является самым простым, однако требует высокой стандартизации и точности выполнения лабораторных процедур. Тест на лекарственную чувствительность состоит из набора пробирок с питательной средой, модифицированной противотуберкулёзными препаратами. Набор состоит из 2-3 пробирок с разными концентрациями каждого из используемых препаратов, одной контрольной пробирки со средой без препарата и одной пробирки, содержащей 1000 мкг/мл сали-циловокислого натрия или 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты для выявления роста нетуберкулёзных микобактерий.

Для приготовления набора сред с препаратами используют модифицированную среду Левенштейна-Йенсена (без крахмала), которую разливают в колбы. В каждую из колб добавляют определённый объём соответствующего разведения противотуберкулёзного препарата. Содержимое колб тщательно перемешивают, разливают в пробирки и свёртывают в наклонном положении в течение 40 мин при температуре 85 °С. Свёртывание среды рекомендуют производить в электросвёртывателе с автоматической регулировкой температуры. Среда с противотуберкулёзными препаратами

1-го ряда может храниться в холодильнике при 2-4 °С в течение 1 мес, с препаратами 2-го ряда - не более 2 нед. Хранение сред с препаратами при комнатной температуре недопустимо. При приготовлении растворов противотуберкулёзных препаратов учитывают их активность, рассчитывая концентрацию с поправкой на молекулярную массу неспецифической части препарата, чистоту и т.д. Для определения лекарственной чувствительности используют только химически чистые субстанции.

Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулёзного препарата, подавляющей рост значительной части популяции микобактерий. При правильном выполнении этот метод имеет хорошую достоверность.

Перед постановкой теста необходимо убедиться, что выделенная культура микобактерий туберкулёза не имеет посторонней микрофлоры. Из культуры микобактерий в 0,9% растворе натрия хлорида готовят гомогенную взвесь, содержащую 500 млн микробных тел в 1 мл (оптический стандарт мутности 5 единиц). Полученную взвесь разводят 0,9% раствором натрия хлорида (1:10) и вносят по 0,2 мл взвеси в каждую пробирку набора питательных сред. Засеянные пробирки помещают в термостат при 37 °С и выдерживают в горизонтальном положении в течение 2-3 сут, чтобы скошенная поверхность питательной среды была равномерно инокулирована взвесью микобактерий туберкулёза. Затем пробирки переводят в вертикальное положение и инкубируют в течение 3-4 нед. Учёт результатов проводят через 3-4 нед.

Поскольку сроки выделения возбудителя из клинического материала на питательных средах составляют не менее 1-1,5 мес, результаты определения лекарственной чувствительности указанным методом можно получить не ранее чем через 2-2,5 мес после посева материала. В этом заключается один из основных недостатков метода.

Интерпретируют результаты определения лекарственной чувствительности микобактерий на основе определённых критериев. На плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на данной пробирке с препаратом, не превышает 20 при обильном росте на контрольной пробирке без препаратов. Только при наличии более 20 колоний культура расценивается как устойчивая к данной концентрации. На практике при получении результатов роста в опытных пробирках, близких к 20 КОЕ. необходимо известить клиническое подразделение, что чувствительность или устойчивость в этом случае носит пограничный характер, так как иногда это может объяснить нечёткую динамику клинических показателей.

Для различных препаратов установлена определённая концентрация, при которой наблюдают размножение критической доли микобактериальной популяции. Эти концентрации носят название «критические». В качестве критерия устойчивости используют величину роста популяции микобактерий на питательной среде с препаратом в критической концентрации.

В отечественной фтизиатрической практике при определении лекарственной устойчивости не ограничиваются определением только критических концентраций. Это связано с тем. что расширенное определение уровня лекарственной устойчивости возбудителя позволяет клиницисту более правильно сформировать тактику химиотерапии, используя знания о потенцирующем действии комбинаций лекарственных препаратов, предвидеть перекрёстную устойчивость или применить более эффективные препараты используемой группы противотуберкулёзных препаратов.

Метод абсолютных концентраций наиболее прост, однако и наиболее чувствителен к допускаемым ошибкам при его выполнении. Более достоверным, особенно при определении чувствительности к препаратам 2-го ряда, и распространённым вне России является метод пропорций. В нём учтены недостатки метода абсолютных концентраций, однако в исполнении он более трудоёмок.

Метод очень похож на метод абсолютных концентраций. Приготовление тестовых пробирок с лекарственными препаратами производят так же. как при методе абсолютных концентраций. Однако посевная доза суспензии микобактерий туберкулёза снижена в 10 раз. что нивелирует частоту спонтанной устойчивости некоторых штаммов микобактерий туберкулёза к таким препаратам, как Этамбутол, протионамид, капреомицин. В качестве контрольных используют 2 или 3 пробирки с посевной дозой, равной в тестируемых пробирках, последовательно разведённых в 10 и 100 раз. Критерием устойчивости служит доля визуально наблюдаемого роста микобактерий туберкулёза. Для препаратов 1-го ряда критерием устойчивости служит превышение роста 1% от исходной популяции, для препаратов 2-го ряда - рост 1 или более 10% от исходной, в зависимости от выбранной критической концентрации.

В 1997 г. рабочая группа ВОЗ и Международного противотуберкулёзного союза по выявлению противотуберкулёзной лекарственной устойчивости внесла коррективы в эти критерии, предложив считать устойчивыми микобактерии, вырастающие на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена при следующих концентрациях:

• дигидрострептомицин - 4 мкг/мл;
• изониазид - 0,2 мкг/мл:
• рифампицин - 40 мкг/мл:
• Этамбутол - 2 мкг/мл.

В 2001 г. критические концентрации были предложены для следующих препаратов 2-го ряда (для критической пропорции в 1%):

• капреомицин - 40 мкг/мл;
• протионамид - 40 мкг/мл;
• канамицин - 30 мкг/мл;
• виомицин - 30 мкг/мл;
• циклосерин - 40 мкг/мл;
• аминосалициловая кислота - 0,5 мкг/мл;
• офлоксацин - 2 мкг/мл.

Результаты роста оценивают через 4 нед как предварительный и через 6 нед культивирования - как окончательный.

Для определения лекарственной чувствительности к пиразинамиду, который широко используют в современной химиотерапии туберкулёза, рекомендуемая критическая концентрация составляет 200 мкг/мл. Однако до сих пор нет общепринятого метода определения лекарственной устойчивости к этому препарату на твёрдых питательных средах, поскольку его антибактериальная активность проявляется только в кислой среде (pH <6), что технически трудно выдержать. К тому же многие клинические культуры микобактерий туберкулёза неохотно растут на яичных средах с кислой средой.

Чтобы оценить качество результатов определения лекарственной чувствительности микобактерий, рекомендовано каждую новую партию среды Левенштейна-Йенсена контролировать параллельным определением чувствительности стандартного музейного штамма H37Rv. Кроме того, существуют определённые микробиологические критерии, которые необходимо выдерживать, чтобы методики давали хорошо воспроизводимый и правильно интерпретируемый результат. К таким можно отнести жизнеспособность культуры микобактерий туберкулёза, правила получения гомогенной взвеси и суспензии, правила отбора культур микобактерий туберкулёза, репрезентативность отобранной бактериальной массы. Достоверность определения лекарственной устойчивости снижается при чрезвычайно скудном бактериовыделении.

В последнее время перспективным признан метод определения лекарственной чувствительности с помощью автоматизированных систем. Наиболее совершенным в этой области являются разработки на основе ВАСТЕС MGIT-960. В этом случае лекарственную чувствительность микобактерий туберкулёза определяют на основе модифицированного метода пропорций. В процессе определения происходит сравнение скорости роста микобактерий туберкулёза в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Для определения чувствительности к стрептомицину, изониазиду, рифам-пицину и этамбутолу используют обогащающие добавки и антибиотики, входящие в набор SIRE kit. Для определения чувствительности к пиразинамиду используют набор PZA kit. В ходе выполнения теста суспензией микобактерий туберкулёза инокулируются тестовые пробирки с лекарственными препаратами, а также контрольные пробирки с разведением суспензии в 100 раз для всех препаратов, за исключением пиразинамида, где разведение суспензии составляет 10 раз. Критерием устойчивости служит индикатор роста микобактерий величиной в 100 GU при достижении роста в контрольной пробирке 400 GU (см. «Культуральные методы выделения микобактерий»). Учёт и интерпретация результатов ведутся автоматически и задаются вводимой или выбранной программой.

В качестве критических концентраций используют финальные концентрации в тестовой пробирке с жидкой питательной средой. В настоящее время разработаны критические концентрации как к препаратам 1-го ряда, так и к некоторым препаратам 2-го ряда. Необходимо отметить, что определение чувствительности микобактерий туберкулёза к циклосерину и аминосалициловой кислоте выполняют только на яичных питательных средах.

Детально разработанный протокол работы по описанной системе позволяет проводить исследование лекарственной чувствительности как на выделенной культуре (с плотной питательной средой), так и с использованием первичного роста микобактерии в MGIT-пробирке. Последний вариант существенно сокращает время проведения культуральных исследований, позволяя получить полные результаты о культуре микобактерий туберкулёза (включая сведения о лекарственной чувствительности) уже через 3 нед с момента сбора материала, в то время как традиционным методом это удаётся получить лишь к 3-му месяцу. Вовремя полученные результаты, когда больной находится в интенсивной фазе лечения, могут компенсировать относительную дороговизну исследований.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Дифференциация микобактерий

С учётом того, что используемые питательные среды не являются строго селективными. последующую дифференциацию выделенных микобактерий признают обязательной. Необходимость дифференциации микобактерий обусловлена рядом особенностей патологических процессов, вызываемых представителями рода: различным течением и исходом туберкулёза и микобактериозов, наличием природной лекарственной резистентности к некоторым противотуберкулёзным препаратам.

Признано, что первичную идентификацию микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулёзных микобактерий осуществляют по следующим характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах, пигментообразование, морфология колоний, наличие кислотоустойчивости и температурный оптимум роста.

К сожалению, не существует какого-либо одного лабораторного метода, позволяющего с достоверностью отличить микобактерии комплекса М. tuberculosis от других кислотоустойчивых микобактерий, тем не менее сочетание вышеописанных признаков с результатами ряда приводимых ниже биохимических тестов позволяет провести идентификацию микобактерий комплекса М. tuberculosis с вероятностью до 95%.

Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis (М. tuberculosis, М. bovis, М. bovisBCG, М. africanum, М. microti, М. canettii и других) от медленно растущих нетуберкулёзных микобактерий применяют основные биохимические тесты, выявляющие наличие следующих признаков:

• способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест):
• нитратредуктазной активности;
• термостабильной каталазы;
• роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).

В качестве дополнительных можно использовать также тесты роста на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты или 5% хлорида натрия.

Многие бактериологические лаборатории идентифицируют эти микроорганизмы лишь на уровне комплекса, что обусловлено ограниченными возможностями лабораторий и методическими возможностями специалистов.

В большинстве же случаев на практике для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis бывает достаточно следующих тестов: ниацинового, на наличие нитратредуктазы, на наличие пиразинамидазы и регистрации роста на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2-карбоксиловой кислоты. При этом учитывают, что микобактерии комплекса М. tuberculosis характеризуются следующей совокупностью признаков:

• медленным ростом (более 3 нед);
• температурой роста в пределах 35-37 ^oС;
• отсутствием пигментообразования (цвет слоновой кости);
• выраженной кислотоустойчивой окраской;
• положительным ниациновым тестом;
• положительным нитратредуктазным тестом;
• отсутствием термостабильной каталазы (68 ^oС).
• отсутствием роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей:
  • 1000 мкг/мл натрия салициловокислого,
  • 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты,
  • 5% хлорида натрия:
• ростом в присутствии 1-5 мкг/мл тиофен-2-карбоксиловой кислоты.

Актуальность дифференциации выделенных микобактерий будет заметно возрастать с ростом частоты регистрации случаев ВИЧ/СПИДа, ассоциированных с туберкулёзом или микобактериозами. В настоящее время нет абсолютной уверенности готовности практических региональных лабораторий корректно выполнять данный объём работ.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Иммунологическая диагностика туберкулеза

Существует целый ряд универсальных феноменов, препаратов и иммунологических тестов, которые первоначально были обнаружены именно при туберкулёзе или на модели иммунного ответа на микобактерии. К ним относят БЦЖ и туберкулин, такой феномен, как кожная ГЗТ (туберкулиновые пробы - реакции Пирке и Манту), реакцию на подкожное введение туберкулина сенсибилизированным животным (феномен Коха). Одни из первых антитела при инфекционном заболевании были также обнаружены при туберкулёзе. Разумеется, чем глубже понимание механизмов противотуберкулёзного иммунитета и их генетического контроля, тем шире может быть использование иммунологических методов и препаратов, воздействующих на иммунитет, для решения практических проблем фтизиатрии.

Самой важной и сложной практической проблемой в настоящее время считают выявление туберкулёза в процессе массового скрининга населения. Однако, несмотря на многочисленные сообщения об «успехах» (на ограниченном материале), нет подходящего для этих целей иммунологического метода (воспроизводимого в «любых руках») и препарата.

Иммунологические методы, в частности серологические исследования (определение антигенов, антител) и туберкулинопровокационные пробы, весьма широко используются в клинической практике.

На первом месте среди иммунологических исследований, применяемых при дифференциальной диагностике, находятся серологические методы - определение антигенов и антител в разных средах организма.

Специфичность определения антител к микобактериям туберкулёза зависит от используемых при иммунном анализе антигенов. Предложено значительное количество антигенов, самый первый из которых - туберкулин ППД:

• ППД и другие комплексные препараты из культуральной жидкости;
• ультразвуковой дезинтеграт;
• тритоновый экстракт и другие комплексные препараты клеточных стенок;
• 5-антиген (Daniel);
• 60-антиген (Coccito);
• липоарабиноманнан;
• корд-фактор (трегалоза-6,6-ди-миколат);
• фенольный и другие гликолипиды;
• липополисахариды;
• фибронектинсвязывающий антиген;
• белки (чаще всего рекомбинантные); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 КДА и др.

В результате многолетних исследований российских и зарубежных учёных были выявлены основные закономерности антителообразования и эффективности серологической диагностики туберкулёза: чем более комплексный антиген, тем выше чувствительность и ниже специфичность тестов. Специфичность в разных странах различается в зависимости от инфицированности населения М. tuberculosis и нетуберкулёзными микобактериями, от проведения вакцинации БЦЖ и др. У детей информативность серодиагностики ниже, чем у взрослых. При первичном туберкулёзе (чаще дети) более информативно определение IgM. при вторичном - IgG. У ВИЧ-ннфицированных информативность серодиагностики при определении антител снижается. Эффективность определения антител зависит от ряда «клинических моментов»: активности процесса (наличия или отсутствия «выделения» микобактерий, наличия полостей распада, степени инфильтрации), распространённости процесса, длительности его течения.

Чувствительность метода иммуноферментного анализа (ИФА) составляет около 70%. Недостаточная эффективность исследования связана с его низкой специфичностью. Ранее рассматривали возможности применения серологического скрининга в группах высокого риска, в частности среди лиц с посттуберкулёзными изменениями в лёгких.

Для повышения специфичности ИФА продолжают поиски более специфичных антигенов, в том числе получаемых генно-инженерным путём: ESAT-6 и др. (см. выше). Применение строго специфичных антигенов (38 кДа, ESAT) повышает специфичность. но значительно уменьшает чувствительность анализа. Наряду с ИФА (экспериментальные лабораторные тест-системы. например Pathozyme ELISA kit) предложены также наборы иммунохроматографические с латеральной фильтрацией (Mycodot), а также другие подобные тесты (дот-анализ на мембране) с визуальной оценкой результата исследования. При проведении этих тестов анализ проходит в течение 10-30 мин; они не требуют специального оборудования, требуют визуальной оценки результатов, что связано с известной субъективностью. Указанные методы имеют примерно те же характеристики чувствительности и специфичности (70% и 90-93% соответственно), что и традиционный ИФА.

Применение методов иммунного анализа имеет определённое значение в качестве дополнительного, учитываемого в комплексе используемых методов, при дифференциальной диагностике туберкулёза, особенно при диагностике его внелёгочных форм. Наибольшую эффективность метод ИФА имеет в диагностике туберкулёзного менингита при исследовании спинномозговой жидкости. В этом случае чувствительность анализа составляет 80-85%, а специфичность 97-98%. Имеются сведения об эффективности определения антител к микобактериям туберкулёза в слёзной жидкости при диагностике туберкулёзного увеита.

Индукция синтеза гамма-интерферона in vitro

Гамма-интерферон (ИФН-γ) - фактор специфической иммунной защиты, реализующейся посредством активирования ферментных систем макрофагов. Индукцию синтеза ИФН-γ сенсибилизированными Т-лимфоцитами вызывает их взаимодействие с антигенами микобактерий.

В качестве антигенов используют как туберкулин ППД. так и специфические антигены, полученные генно-инженерным путём, в частности антигены ESAT-6 (ранний секретируемый антиген с молекулярной массой 6 кДа) и CFP-10 (белок культурального фильтрата, 10 кДа). Генно-инженерные или рекомбинантные антигены отсутствуют в клетках вакцины БЦЖ и других микобактерий. При использовании туберкулина результаты теста индукции ИФН-γ сопоставимы с результатами туберкулинового кожного теста (прямая корреляция). При использовании генно-инженерных антигенов результаты теста более специфичны и не зависят от предшествующей вакцинации БЦЖ. При обследовании вакцинированных лиц, не имевших контакта с туберкулёзной инфекцией, специфичность теста составляет 99%. Чувствительность теста среди больных туберкулёзом колеблется от 81 до 89%.

Разработаны тесты и диагностикумы, основанные на краткосрочном культивировании клеток цельной крови или мононуклеарных клеток, выделенных из крови, с антигенами микобактерий туберкулёза in vitro с последующим определением концентрации ИФН-γ или подсчётом числа Т-лимфоцитов, синтезирующих ИФН-γ. Концентрацию интерферона, синтезированного в пробирке, определяют методом ИФА с использованием моноклональных антител, связывающих ИФН-γ. Затем с помощью калибровки стандартного ИФН-γ определяют его концентрацию в пробирке или лунках планшета.

При проведении теста Elispot количество Т-лимоцитов, синтезирующих ИФН-γ. подсчитывают на поверхности чашки, покрытой антителами к ИФН-γ.

разработчики диагностикума на основе индукции ИФН-γ in vitro, который утверждён Агентством по лекарствам и продуктам США, утверждают, что с помощью теста невозможно дифференцировать латентную туберкулёзную инфекцию от активного туберкулёза. Поэтому в регионах с высоким уровнем инфицированности тест не имеет прямого диагностического значения. Однако в нашей стране его можно применять для дифференцирования туберкулёзной инфекции у детей от поствакцинальной аллергии, а также для оценки уровня специфического иммунитета в процессе лечения.

В настоящее время проходит стадию изучения отечественная тест-система для определения индукции синтеза ИФН-γ специфическими туберкулёзными антигенами in vitro.

Иммунный статус и течение туберкулёза, иммунокоррекция

В процессе лечения туберкулёза у людей происходят изменения антигенемии и состояния иммунной системы.

Данные об изменениях в экссудатах и тканях в значительной мере противоречивы. Единственное, что можно отметить с полным основанием, - это то, что в туберкулёзных гранулёмах, как правило, обнаруживается значительное число активированных Т-лимфоцитов.

Имеет смысл остановиться ещё на двух положениях, которые необходимы, чтобы понять роль иммунологических механизмов в лечении туберкулёза у человека:

• у больных СПИДом особенно высока частота развития множественной лекарственной устойчивости;
• при множественной лекарственной устойчивости (и в отсутствие ВИЧ-инфекции) нарушения иммунитета (в первую очередь Т-клеточного звена) особенно существенны.

При туберкулёзе широко применяют различные методы иммунокоррекции: это в первую очередь препараты, действующие преимущественно на Т-клеточный иммунитет и систему мононуклеарных фагоцитов (гормоны тимуса, изофон, ликопид, полиоксидоний и др.). а также цельные (аттенуированные) микобактерии и их компоненты.

Молекулярно-биологическая диагностика туберкулеза

К методам молекулярной биологии в диагностике инфекционных заболеваний относят, в основном, методы, основанные на манипулировании с геномными материалами бактериальных и вирусных возбудителей с целью выявления специфического генетического материала - участков ДНК с нуклеотидной последовательностью, специфической в отношении данного вида или штаммов возбудителя, для анализа специфических последовательностей ДНК в генах, определяющих чувствительность возбудителя к определённым лекарственным веществам, а также для анализа функциональной активности определённых генов возбудителя. Молекулярно-биологические методы получили большое распространение в научных исследования и практическое применение в диагностике и контроле различных бактериальных и вирусных инфекций после открытия в 1985 г. Кэрри Мюллисом (лауреат Нобелевской премии. 1989) полимеразной цепной реакции.

Принципы и возможности метода полимеразной цепной реакции

ПЦР позволяет амплифицировать (размножить) в пробирке нуклеотидную последовательность (фрагмент ДНК возбудителя) в течение нескольких часов в миллионы раз. Проведение реакции при наличии единичных цепей ДНК определяет исключительно высокую чувствительность анализа.

Нуклеотидная последовательность определённых участков в цепи ДНК определяет генетическое своеобразие микроорганизма, что объясняет высокую специфичность ПЦР.

Значение этого метода для обнаружения и исследования характеристик микобактерий туберкулёза обусловлено биологическими особенностями микроорганизма, обладающего очень медленным ростом: время удвоения ДНК микобактерий туберкулёза при их культивировании составляет 12-24 ч.

Принцип метода ПЦР состоит в амплификации - многократном, в миллионы раз. умножении участков специфической последовательности ДНК в пробирочном микрообъёме при циклическом повторении следующих трёх стадий реакции, каждая из которых проходит в различном температурном режиме:

• I стадия - денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании с расхождением её цепей;
• II стадия - комплементарное связывание (гибридизация) праймеров (затравочных олигонуклеотидов) с концевыми участками цепей строго специфического, избранного для умножения фрагмента ДНК;
• III стадия - достройка цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

Для амплификации в пробирке должны быть молекулы матричной ДНК. четыре вида дезоксинуклеозидтрифосфатов (нуклеотидов), содержащих соответствующие азотистые основания: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц); искусственно синтезированные затравочные олигонуклеотиды (праймеры), состоящие из 18-20 пар оснований; термостабильный фермент ДНК-полимераза, имеющий температурный оптимум 68-72 ^оС, и ионы магния.

Специфичность ПЦР зависит от выбора фрагмента ДНК. В соответствии с ним синтезируют фланговые затравочные олигонуклеотиды. Специфичность гибридизации и достройки цепи ДНК обусловлена принципом комплементарности следующих пар азотистых оснований: аденин-тимин, гуанин-цитозин.

Для определения генома микобактерий туберкулёзного комплекса наиболее эффективной мишенью амплификации в большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в большинстве штаммов микобактерий туберкулёза имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа. В то же время описаны штаммы микобактерий туберкулёза с малым числом повторов или отсутствием фрагмента IS6110.

Выделение молекул ДНК из биологического образца

Для проведения ПЦР молекулы ДНК возбудителя должны быть выделены из биологического материала в минимальном объёме, при минимальном количестве неспепифической ДНК и различных ингибиторов фермента - ДНК-полимеразы.

Подготовка проб должна проводиться в условиях, предотвращающих перекрёстное загрязнение исследуемых образцов выделяемыми молекулами ДНК. Для этого необходима предварительная обработка помещения ультрафиолетом, полов и рабочих поверхностей столов и приборов - хлорсодержащими растворами. Также необходимо обязательное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам.

Для выделения ДНК микобактерий туберкулёза из клинических образцов (спинномозговая жидкость, бронхиальный смыв), не содержащих большого числа лейкоцитов, клеточного детрита или солей, достаточно центрифугировать пробу при 3-4 тыс. оборотов в минуту, добавить к осадку 20-30 мкл 2% раствора тритона Х-100 и прогреть при 90 ^оС в течение 30 мин.

Для подготовки проб мокроты необходимо эффективное разжижение, для которого обычно используют 4% раствор натрия гидроксида и N-ацетил-L-цистеин (NALC) в количестве 50-80 мг на пробу - в зависимости от вязкости образца. Раствор NALC должен быть приготовлен ex tempore либо порошок NALC можно добавить в сухом виде непосредственно в пробу. После разжижения необходимо центрифугирование проб в течение 15 мин при 3,5-4 тыс. оборотов в минуту (3000 g) в пробирках объёмом 50 мл с завинчивающимися крышками, т.е. в тех же условиях, которые рекомендуются для предпосевной подготовки мокроты.

Для экстракции ДНК из осадка чаще применяют метод, основанный на использовании 5-6-молярного раствора гуанидин-изотиоцианата в качестве лизирующего реагента и микропористых частиц оксида кремния («диатомовая земля»), сорбирующих молекулы ДНК. Неспецифические вещества, в том числе возможные ингибиторы, затем отмывают в 2,5-молярном растворе гуанидин-изотиоцианата и растворе этанола, после чего десорбируют молекулы ДНК в воде, и эти образцы используют для проведения ПЦР. Для упрощения технологии выделения ДНК «диатомовую землю» нередко заменяют магнитными микрочастицами, покрытыми оксидом кремния. При этом для осаждения частиц вместо центрифугирования применяют специальный магнитный штатив для микропробирок.

В России разработан оригинальный метод иммуномагнитной сепарации микобактерий с последующей экстракцией ДНК возбудителя. Для иммуномагнитной сепарации микобактерий туберкулёза используют феррочастицы размером 3-5 мкм, покрытые оксидом кремния, к которым присоединены посредством химической связи поликлональные (кроличьи) антитела к микобактериям туберкулёза. Образцы мокроты после щелочного лизиса нейтрализуют кислым раствором трис-HCl и инкубируют с иммуномагнитным сорбентом. Затем иммуноферрочастицы собирают с помощью магнитной палочки со сменным наконечником, переносят в микропробирку, осаждают. вносят 20-30 мкл 2% раствора тритона Х-100 и прогревают 30 мин при 90 ^oС. Надосадочную жидкость используют в качестве ДНК-матрицы для ПЦР-анализа.

Сложной проблемой является выделение ДНК микобактерий туберкулёза из биоптатов. Для лизиса биоптата используют фермент - протеиназу К в конечной концентрации 200-500 мг/л при температуре 56 ^oС в течение ночи. Далее выделяют одним из известных методов. Избыток неспецифической ДНК при ПЦР-анализе биоптатов нередко служит причиной ингибирования реакции, что требует повторного экстрагирования ДНК.

Методы детекции результатов

После завершения реакции амплифицированные фрагменты ДНК возбудителя идентифицируют с помощью различных методов.

Хорошо известен метод гельэлектрофореза. При этом полученный фрагмент ДНК идентифицируют по положительному контролю, содержащему искомый специфический фрагмент ДНК, или по заранее известному размеру (числу нуклеотидных пар) фрагмента, который определяют с помощью стандартного молекулярного маркёра.

В присутствии специфического красителя - этидия бромида, включающегося в двухцепочечную ДНК. синтезированный фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета полосы.

Размер фрагмента ДНК, определяемый при электрофорезе по расстоянию пробега от старта, должен соответствовать известному маркёру молекулярного веса или положительному контролю.

Другие методы определения результатов ПЦР основаны на гибридизации одно-цепочечных продуктов ПЦР с комплементарным к ним олигонуклеотидом - ДНК-зондом, меченным биотином, с последующей детекцией с помощью ферментативной реакции посредством, например, связывания с биотином конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза.

На основе такого типа детекции созданы ПЦР-анализаторы, в которых детекция результатов ПЦР проводится автоматически в результате считывания оптической плотности в образцах после проявления ферментативной реакции.

Недостатки указанных методов заключаются в возможностях внутрилабораторной контаминации довольно короткими фрагментами молекул ДНК. Эти молекулы при попадании во вновь исследуемые образцы становятся матрицей для ПЦР и приводят к ложноположительным результатам.

В связи с этим для предотвращения ложноположительных результатов вводятся жёсткие правила разделения и изолирования помещений: для выделения ДНК из биологических образцов; помещения для детекции результатов (электрофорезная) от чистой зоны. Эти помещения представляют собой зону вероятной контаминации. Другая изолированная зона - чистое помещение для внесения исследуемых образцов ДНК в пробирки с реакционной смесью для проведения ПЦР. И наконец, предполагается, что основной прибор - ДНК-амплификатор - должен быть вынесен в отдельное, возможно офисное, помещение.

Для предотвращения контаминации продуктами предшествующих реакций - амп-ликонами некоторые ПЦР-тест-системы вместо дезоксинуклеозидтимидина содержат дезоксинуклеозидуридин, который при синтезе цепи in vitro встраивается вместо него в соответствующую позицию, т.е. азотистое основание тимин, присутствующий в нативной ДНК, замещается на урацил. Урацил-ДНК-гликозилаза, добавляемая в реакционную смесь к анализируемому материалу, разрушает только контаминирующие фрагменты с дезоксиуридином, но не нативную анализируемую ДНК. содержащую дезокситимидин. Последующее прогревание при 94 ^oС инактивирует этот фермент и не препятствует амплификации в ПЦР.

Существует тест-система, основанная на изотермальной амплификации рРНК, для чего проводят вначале обратную транскрипцию и синтез молекул ДНК. являющихся, в свою очередь, матрицей для последующего синтеза молекул РНК. Ампликоны РНК детектируются с помощью окрашенного акридином ДНК-зонда при гибридизации в растворе реакционной пробирки. Этот метод, помимо высокой чувствительности, имеет преимущество проведения анализа в одной пробирке, что предотвращает контаминацию. По данным авторов, чувствительность этого метода в респираторных образцах достигает 90% при специфичности 99-100%.

Новые методы детекции реализованы в ПЦР в режиме реального времени. Эти методы отличаются прежде всего тем, что ПЦР и детекция её результатов осуществляются одновременно в одной закрытой пробирке. Это не только технологически упрощает методику проведения анализа, но и предотвращает контаминацию лабораторных помещений и исследуемых образцов продуктами предшествующих ПЦР.

При ПЦР в реальном времени детекция результатов происходит за счет флюоресценции, возникающей при гибридизации флюорогенного ДНК-зонда с амплифици-руемым в ходе ПЦР специфическим фрагментом ДНК. Структура флюорогенных ДНК-зондов построена таким образом, что флюоресцентный маркёр высвобождается в результате ферментативной реакции или дистанцируется от молекулы гасителя флюоресценции только при специфической гибридизации с искомой молекулой ДНК, амплифицируемой в ходе ПЦР. При росте числа гибридизированных с зондом молекул возрастание флюоресценции до детектируемого уровня пропорционально числу молекул амплифицированного продукта. Поскольку при каждом цикле ПЦР количество молекул фрагмента ДНК умножается вдвое, номер цикла, с которого флюоресценция определяется и возрастает, обратно пропорционален числу молекул ДНК в исходном образце. Если в реакцию ввести в качестве калибратора несколько различных известных концентраций молекул соответствующего фрагмента ДНК микобактерий туберкулёза, то с помощью компьютерной программы может быть рассчитано и количество геномов ДНК в исследуемом материале.

Каждый стандартный образец дублирован. Количественный критерий - минимальное число циклов ПЦР, необходимое для начала и роста определяемой флюоресценции. По оси абсцисс - количество циклов; по оси ординат - величина флюоресценции. Концентрации ДНК обратно пропорциональны числу циклов, необходимых для появления флюоресценции. В окнах правой колонки (21-32) отмечены номера циклов для соответствующих концентраций. Различия между 10-кратными концентрациями фрагментов ДНК 10²-10⁶мл - 3.2-3.4 цикла. Для двух пациентов концентрации фрагментов IS6110 составили около 10³/мл и 10⁴/мл. С учётом числа повторов (6-20) анализируемых фрагментов в геноме микобактерий туберкулёза число мико-бактерий в клинических образцах - около 100 и 1000 клеток соответственно.

Применение ПЦР в диагностике туберкулёза

Метод ПЦР в наибольшей степени применяется для ускоренной диагностики туберкулёза - обнаружения микобактерий туберкулёза в клинических образцах: мокроте. промывных водах бронхов, плевральном экссудате, моче, спинномозговой жидкости, пунктатах остеолизиса, аспиратах женских половых путей и различных биоптатах. При исследовании в Голландии около 500 образцов мокроты и бронхиальных смывов от 340 больных с подтверждённым диагнозом туберкулёза лёгких были изучены сравнительная чувствительность методов ПЦР, культурального исследования и микроскопии мазков. Чувствительность анализа составила 92,6,88,9 и 52,4% соответственно. При этом специфичность всех методов была около 99%.

Проведено сравнение эффективности обнаружения микобактерий туберкулёза методами микроскопии мазков, посева на среду Левенштейна-Йенсена, тест-системы ВАСТЕС и ПЦР-анализа. ПЦР демонстрировала чувствительность 74,4%, микроскопия - 33,8%, посев на плотную среду - 48,9% и ВАСТЕС - 55,8%. Среднее время детекции для посева на среде Левенштейна-Йенсена - 24 дня. ВАСТЕС - 13 дней, ПЦР - 1 день.

Возможности применения ПЦР в качестве чувствительного и быстрого метода контроля эффективности лечения туберкулёза также обсуждаются.

Обнаружение ДНК микобактерий туберкулёза методом ПЦР при эффективной химиотерапии определяется в течение более длительного времени - в среднем на 1,7 мес по сравнению с бактериовыделением, определяемым при люминесцентной микроскопии, и на 2,5 мес по сравнению с бактериологическим исследованием.

Диагностика внелегочных форм туберкулеза

Значение ПЦР как чувствительного метода особенно велико для внелёгочных форм, поскольку именно при этих формах клинико-рентгенологические методы и традиционные бактериологические методы определения микобактерий туберкулёза в диагностических материалах малоэффективны.

При исследовании образцов мочи результаты ПЦР-анализа были положительными у 16 из 17 больных активным туберкулёзом мочевой системы и отрицательными у 4 больных неактивным туберкулёзом почек и 39 пациентов с нетуберкулёзными заболеваниями мочевой системы.

Продемонстрирована эффективность ПЦР-анализа при исследовании костномозговых аспиратов у больных лихорадкой неясного генеза при подозрении на туберкулёзный характер заболевания. Для диагностики туберкулёзного лимфаденита у детей были изучены 102 пункционных аспирата и биоптата 67 детей с подозрением на туберкулёзный лимфаденит. Положительные результаты были получены: методом ПЦР в реальном времени - 71.6%. флюоресцентной микроскопии - 46,3%. культурального исследования - 41,8%. При исследовании 50 биоптатов лимфоузлов у пациентов с болезнью «кошачьих царапин» все результаты были отрицательными. Таким образом, была продемонстрирована 100% специфичность ПЦР-анализа. В этой же работе при пункционной биопсии лимфоузлов была показана возможность обнаружения М. avium.

Диагностика туберкулёза женской половой сферы при бесплодии, как известно, является одной из наиболее трудных проблем диагностики. При исследовании с помощью ПЦР биопсий эндометрия, эндометриальных аспиратов и образцов жидкости из дугласова пространства у 14 (56%) из 25 пациенток, обследованных лапароскопически с подозрением на туберкулёз, были получены положительные результаты. С помощью микроскопии мазка и культурального исследования были получены 1 и 2 соответственно положительных результата. Эти случаи также были ПЦР-положительными. Большинство ПЦР-положительных результатов относилось к случаям с характерными признаками туберкулёза по данным гистологического исследования; меньшее число - при подозрении на туберкулёз по данным лапароскопии. Лишь один положительный результат ПЦР-анализа был получен при отсутствии лапароскопических данных на туберкулёз.

При диагностике внелёгочных форм туберкулёза у клиницистов нередко возникает вопрос о возможности выявления возбудителя при исследовании методом ПЦР образцов крови. Литературные данные свидетельствуют, что выявление ДНК микобактерий туберкулёза из образцов крови возможно при далеко зашедших формах ВИЧ-инфекции. Обнаруживали ДНК микобактерий туберкулёза лишь при генерализованном туберкулёзе различных органов у пациентов с трансплантированной почкой и иммунодепрессией.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Видовая идентификация микобактерий

Метод ПЦР может быть достаточно эффективен для быстрой идентификации микобактерий туберкулёзного комплекса и некоторых видов нетуберкулёзных микобактерий после получения их первичного роста. В этом случае использование ПЦР может экономить 7-10 дней, необходимых для последующей культуральной идентификации положительного результата. Исследование методом ПЦР является технически очень простым, поскольку не требует сложной пробоподготовки клинического материала для достижения высокой чувствительности. При исследовании 80 положительных в такой тест-системе (MB ВасТ. фирмы Organon) культур все положительные результаты ПЦР-анализа были строго специфичны и проводились в течение 1 дня. Для идентификации других видов микобактерий при получении их в культуре ДНК возбудителя гибридизуется со специфическими ДНК-зондами, меченными акридином, и штаммы детектируют по появлению хемилюминесценции с помощью хемилюминометра или на полосках нитроцеллюлозы с визуальной оценкой после гибридизации. С помощью такого набора идентифицируют ограниченное число видов: комплекс микобактерий туберкулёза. M. avium, M. avium complex, M. kansasii и M. gordonae.

A.Telenti и соавт. разработали также относительно простой и недорогой метод видовой идентификации клинически важных видов микобактерий на основе ПЦР и последующей обработки двумя рестрикционными ферментами (ферменты, обладающие свойствами рассечь молекулу ДНК в специфических точках). При этом амплифицируют фрагмент ДНК. кодирующий белок теплового шока (65 кДа), после чего обрабатывают полученный в ПЦР фрагмент ДНК размером 439 нуклеотидных пар раздельно двумя ферментами - Bste II и Нае III. Затем анализируют, используя агарозный гельэлектрофорез, полученные два продукта, определяя их размеры (число нуклеотидных пар) с помощью набора стандартных фрагментов ДНК (молекулярных ДНК-маркёров) длиной от 100 до 1000 нуклеотидных пар. В каждом из определённых видов (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) обнаруживают 2 или 3 фрагмента ДНК различного размера для каждого рестрикционного фермента. Комбинация получаемых различного размера фрагментов ДНК позволяет дифференцировать эти виды между собой.

Разрабатывается технология биологических ДНК-микрочипов. которая поможет идентифицировать более 100 видов микобактерий в одном исследовании.

Видовая идентификация может быть проведена также с помощью ПЦР-амплификации вариабельной области 16S rРНК с последующим секвенированием ампликонов при сравнении с соответствующей первичной структурой, что позволяет идентифицировать более 40 видов микобактерий.

С помощью ПЦР может быть также проведена видовая идентификация внутри комплекса микобактерий туберкулёза, в том числе дифференцирование M. bovis и M. bovis BCG. Для этого анализируется наличие или отсутствие некоторых генов в геномных областях RD1. RD9 и RD10. RD1 отсутствует в М. bovis BCG, но присутствует в вирулентных видах, в том числе в M. bovis.

Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с помощью ПЦР

Задачи молекулярно-генетических методов определения лекарственной чувствительности или устойчивости микобактерий туберкулёза сводятся к выявлению мутаций в определённых нуклеотидных последовательностях известных генов. Основные методы основаны либо на прямом прочитывании (секвенировании) этих последовательностей после амплификации, либо на гибридизации биотин-меченых фрагментов ДНК, амплифицированных в ходе ПЦР с ДНК-зондами. Оба варианта предполагают выявление замен в нуклеотидных последовательностях, которые при использовании ДНК-зондов приводят к отсутствию или неполноценной гибридизации на нитроцеллюлозной мембране с помощью ферментного конъюгата (стрептавидин-щелочная фосфатаза) - метод LIPA-Rif-TB.

Метод измерения флюоресценции в локально фиксированных на микроучастках ДНК-зондах, комплементарных к известным мутациям в амплифицированных с помощью ПЦР участках генов, ответственных за лекарственную чувствительность или устойчивость, получил название метода микробиочипов. Основной алгоритм проведения этого исследования следующий. После выделения ДНК из клинического образца или культуры микобактерий необходимо провести ПЦР для амплификации соответствующих фрагментов гроВ гена, ответственного за лекарственную чувствительность к рифампицину, или katG и inhA генов, кодирующих белки микобактерий, ответственные за чувствительность к изониазиду. Результаты ПЦР оценивают с помощью агарозного гельэлектрофореза, при котором подтверждают получение соответствующих фрагментов ДНК искомой длины. Затем проводят 2-й раунд ПЦР для введения в ДНК флюоресцентной метки. Результаты ПЦР вновь подтверждают при гельэлектрофорезе. После этого проводят гибридизацию (инкубация в течение ночи) с последующей отмывкой полученного материала на биочипе, который представляет собой большое число фиксированных на маленькой стеклянной пластинке коротких цепей ДНК (зондов), комплементарных к нуклеотидным последовательностям чувствительного к лекарствам типа микобактерий туберкулёза в точках возможных мутаций. а также к мутантным последовательностям, ответственным за лекарственную устойчивость. Расположение ДНК-зондов на пластинке - строго определённое, а уровень наблюдаемой флюоресценции при гибридизации для определения результата с помощью специального считывающего устройства установлен. В связи с этим результаты анализа определяются с помощью специальной компьютерной программы.

В последние годы развиваются и альтернативные методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулёза на основе технологии ПЦР в реальном времени, позволяющие проводить эти исследования в режиме закрытой пробирки.

На рис. 13-13 представлен результат анализа клинических культур микобактерий туберкулёза при определении лекарственной устойчивости к рифампицину с помощью ПЦР в реальном времени: 218 - контрольный образец (чувствительный к рифампицину); 93 - положительный контроль на мутацию Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - положительный контроль на мутацию Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - экспериментальные образцы. Результат расчёта кинетических кривых амплификации по 4 каналам: канал 1: 393 - положительный контроль на мутацию Ser-Trp TCG-TGG; канал 2: 4482 - положительный контроль на мутацию Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - экспериментальные образцы; канал 4: кинетические кривые амплификации всех образцов, участвующих в эксперименте. Положительный контроль реакции амплификации. Выводы: по результатам анализа выявлены следующие мутации, определяющие устойчивость к рифампицину: в образцах 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Этот же принцип использован для определения лекарственной устойчивости к изониазиду по генам katG и inhA, определяющим наиболее частые мутации.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Штаммовая идентификация микобактерий туберкулеза

Наиболее изученным методом штаммовой идентификации микобактерий туберкулеза является технология, называемая полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ,. или RFLP в английском варианте) и которая основана на фрагментированин (рестрикции) ДНК микобактерий туберкулёза ферментом Pvu II и последующей гибридизации полученных фрагментов с определёнными специфическими последовательностями на ДНК её повторяемого элемента IS6110. Внутривидовая вариабельность реализуется за счёт различного числа повторов IS6110 и их расположения на ДНК. а также разнообразия расстояний между определёнными точками атаки фермента рестриктазы (сайты рестрикции) и элементом IS6110. Эта технология является весьма сложной и трудоёмкой. После обработки ДНК, выделенной из культуры микобактерий туберкулёза, рестриктазой проводят гельэлектрофорез, затем переносят фрагменты ДНК различной длины на нитроцеллюлозную мембрану, проводят гибридизацию с фрагментами IS6110-элемента и выявляют результаты с помощью ферментативной реакции. Получаемый специфический рисунок полос характеризует ДНК конкретного штамма микобактерий туберкулёза. С помощью компьютерного анализа выясняется идентичность или родственность штаммов. Несмотря на то что метод ПДРФ является наиболее дискриминативным, т.е. выявляет наибольшее число различий в анализируемых штаммах, он малоэффективен при малом числе (менее 5) IS6110-повторов, наблюдаемых в некоторых штаммах. На рис. 13-14 представлены результаты ПДРФ-типирования штаммов.

Альтернативой может быть метод сполиготипирования (spoligotyping) - анализ полиморфизма спейсерных последовательностей ДНК - промежуточных между прямыми повторами DR-области. При проведении сполиготипирования штаммов проводят ПЦР с праймерами, ограничивающими DR-участок, после чего образуются фрагменты различной длины, которые гибридизуют с вариабельными промежуточными участками ДНК. Анализ спейсерных последовательностей DR-области представляется. по данным исследователей, более простым, производительным и пригодным для первичного скрининга штаммов и предварительного эпидемиологического анализа, а также исследования непосредственно клинического материала.

Очевидно, более эффективным и технологически доступным методом является VNTR (аббревиатура английских слов), или метод определения вариабельного числа точных тандемных повторов в ДНК микобактерий туберкулёза. Этот метод основан только на использовании ПЦР и не требует дополнительных манипуляций. Поскольку число тандемных повторов в разных штаммах и в разных локусах различно, на получаемой электрофореграмме продуктов ПЦР определяются и анализируются фрагменты различного размера. По мнению исследователей, с помощью VNTR достигается большая степень дискриминации штаммов, чем с помощью метода ПДРФ.

Большое внимание в последние годы уделяется распространению штаммов микобактерий туберкулёза семейства W-Beijing (иногда их называют пекинским штаммом), которые в значительной части обладают лекарственной устойчивостью.

Основные требования к качеству молекулярно-биологических исследований

[72], [73], [74], [75],

Основные нормативные документы при проведении ПЦР

Приказы Минздрава России: №45 от 7.02.2000 г.. № 109 от 21.03.2003 г.. № 64 от 21.02.2000 г. Методические указания: 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности»; 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». 2003 г.; 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПЦР», 2001 г. Приложение 11 к Инструкции по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза.

[76], [77], [78]

Персонал

Выполнение молекулярно-биологических исследований могут проводить врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи, биологи клинико-диагностической лаборатории, а также специалисты со средним медицинским образованием, прошедшие специализацию и повышение квалификации в установленном порядке.

Устройство помещений лаборатории

Необходимы следующие лабораторные помещения:

• Зона обработки проб - лаборатория, приспособленная для работы с инфекционными агентами III-IV групп патогенности, согласно Методическим указаниям 13.1888-04.
• Зона для приготовления реакционных смесей ПЦР - лабораторное помещение, в котором предусматривается защита от внутренней лабораторной контаминации - «чистая» зона.
• • Если для анализа продуктов ПЦР используется метод электрофореза, или гибридизации. лабораторное помещение, в котором размноженные фрагменты ДНК извлекаются из амплификационной пробирки и, соответственно, могут попасть в окружающую среду, в соответствии с требованиями к ПЦР-лабораториям (Методические указания 1.3.1794-03, Методические указания 1.3.1888-04) должно быть полностью изолировано от помещений, указанных в предыдущих пунктах. Должно быть исключено перемещение из зоны для электрофореза в зону для обработки проб и «чистую» зону какого-либо персонала, оборудования, любых материалов и предметов, а также перенос воздуха через систему вентиляции или в результате сквозняков. Эта зона не требуется при флуориметрической детекции продуктов ПЦР.
• Помещение для ведения документации и обработки результатов оборудуется компьютерами и необходимой оргтехникой. В этом помещении может располагаться оборудование, обеспечивающее детекцию продуктов ПЦР без вскрытия пробирки. - флюоресцентные ПЦР-детекторы и термоциклеры для ПЦР в реальном времени.

Санитарно-эпидемиологические требования к первичной обработке мокроты аналогичны стандартным микробиологическим требованиям для работы с микобактериями туберкулёза.

[79], [80], [81], [82],

Комплектация лабораторного оборудования для ПЦР-диагностики

В комплектацию лаборатории входит оборудование для следующих комнат.

• комната пробоподготовки, содержит следующее оборудование: ламинар II класса защиты «СП-1.2»: твёрдотельный термостат с греющейся крышкой для пробирок типа «Эппендорф»; микроцентрифуга на 13 ООО оборотов в минуту; центрифуга («Вортекс»); холодильник с диапазоном температуры от -20 ^оС до +10 ^оС; пипетки переменного объёма серии «Рroline»; насос с колбой-ловушкой ОМ-1; штатив для пипеток; штатив рабочее место 200x0,5 мл; штатив рабочее место 50x1.5 мл; штативы для хранения пробирок 80x1.5 мл;
• комната приготовления реакционной смеси: защитная камера ПЦР-бокс («Ламинар-C. 110 cм); центрифуга-«Вортекс»; пипетки переменного объёма серии «Рrоline»; штатив для пипеток; штатив рабочее место 200x0.2 мл; штативы для хранения пробирок 80x1.5 мл; холодильник с диапазоном температуры от -20 ^оС до+10 ^оС;
• комната для электрофореза: камера для горизонтального электрофореза; источник питания; трансиллюминатор;
• ДНК-амплификатор или анализатор нуклеиновых кислот (ПЦР в реальном времени) с компьютером и программным обеспечением; может быть помещён в любую свободную комнату. Если используется технология ПЦР в реальном времени. комната для электрофореза не нужна.

[83], [84], [85], [86]

Внешний контроль качества

Для уверенности в получении объективно достоверных результатов лаборатории должны участвовать в системе внешней оценки качества лабораторных исследований.

Участники системы контроля качества получают; 12 ампул с лиофилизированными суспензиями бактериальных клеток, две из которых содержат кишечную палочку Е. Coir, 3 ампулы с микобактериями туберкулёза (авирулентный штамм) в концентрации 10²/мл; 3 ампулы с клетками аналогичного штамма в концентрации 10⁴/мл; по 2 ампулы с нетуберкулёзными микобактериями М. avium-intracellulare и М. kansasii в концентрации 10⁵/мл.

Рассылаемые тесты для проведения внешней оценки качества предварительно проходят испытания в двух независимых лабораториях, имеющих большой опыт работы в данной области.

[87], [88]