Ограничения, опасности и осложнения клеточной трансплантации

Осложнения терапии стволовыми клетками

Осложнения при трансплантации костного мозга чаще всего являются гематологическими и связаны с длительным периодом ятрогенной панцитопении. Наиболее часто развиваются инфекционные осложнения, анемия и геморрагии. В связи с этим крайне важен подбор оптимального режима забора, процессинга и хранения костного мозга для максимальной сохранности стволовых клеток, что обеспечит быстрое и стабильное восстановление кроветворения. При характеристике трансплантата в настоящее время принято оценивать следующие параметры: количество мононуклеарных и/или ядросодержащих клеток, колониеобразующих единиц и содержание СБ34-позитивных клеток. К сожалению, эти показатели дают только косвенную оценку реальной кроветворной способности стволовой клеточной популяции трансплантата. На сегодня не существует абсолютно точных параметров определения достаточности трансплантата для долговременного восстановления гемопоэза у пациентов даже при аутологичной трансплантации костного мозга. Разработка общих критериев крайне затруднена из-за отсутствия жестких стандартов процессинга, криоконсервации и тестирования трансплантата. Кроме того, необходимо учитывать все многообразие факторов, влияющих на параметры успешного восстановления кроветворения у каждого конкретного больного. При аутологичной трансплантации костного мозга наиболее важными из них являются число предшествующих курсов химиотерапии, особенности режима кондиционирования, период заболевания, в который произведен забор костного мозга, схемы применения колониестимулирующих факторов в посттрансплантационном периоде. К тому же не следует забывать, что предшествующая забору трансплантата химиотерапия может оказать негативное влияние на стволовые клетки костного мозга.

Частота развития тяжелых токсических осложнений существенно возрастает при проведении аллогенной трансплантации костного мозга. В связи с этим представляют интерес статистические данные по пересадке аллогенного костного мозга при талассемии. В отчетах Европейской группы трансплантации костного мозга зарегистрировано около 800 пересадок костного мозга пациентам с большой талассемией. Аллогенная трансплантация при талассемии в подавляющем большинстве случаев выполняется от HLA-идентичных сибсов, что связано с тяжелыми осложнениями и высокой смертностью при трансплантации стволового клеточного материала частично совместимых родственных или совместимых неродственных доноров. Для максимального снижения риска фатальных инфекционных осложнений пациенты помещаются в изолированные асептические боксы с ламинарным потоком воздуха, получают низко- или абактериальную диету. Для бактериальной деконтаминации кишечника per os назначают нерезорбционные формы антибиотиков, противогрибковые препараты. С целью профилактики внутривенно вводят амфотерицин В. Профилактику системных инфекций закрепляют амикацином и цефтазидимом, которые назначают за день до трансплантации, продолжая лечение до выписки пациентов. Все препараты крови перед переливанием облучаются в дозе 30 Гр. Парентеральное питание при трансплантации является необходимым условием и начинается сразу по ограничению приема пищи естественным путем.

Целый ряд осложнений связан с высокой токсичностью иммунодепрессивных препаратов, которые часто вызывают тошноту, рвоту и мукозиты, повреждение почек и интерстициальную пневмонию. Одним из самым тяжелых осложнений химиотерапии является веноокклюзионная болезнь печени, приводящая к смерти в ранний посттрансплантационный период. Среди факторов риска тромбоза вен портальной системы печени следует отметить возраст пациентов, наличие гепатита и фиброза печени, а также проведение иммуносупрессивной терапии после трансплантации костного мозга. Веноокклюзионная болезнь особенно опасна при талассемии, которая сопровождается гемосидерозом печени, гепатитом и фиброзом - частыми спутниками транс- фузионной терапии. Тромбоз вен портальной системы печени развивается через 1-2 недели после трансплантации и характеризуется быстрым увеличением содержания в крови билирубина и активности трансаминаз, прогрессированием гепатомегалии, асцитом, энцефалопатией и болями в верхней половине живота. Гистологически в аутопсийном материале определяются повреждения эндотелия, субэндотелиальные геморрагии, поражение центролобулярных гепатоцитов, тромботическая обструкция венул и центральных вен печени. У больных талассемией описаны случаи фатальной остановки сердца, связанной с токсическим воздействием цитостатиков.

В период подготовки к трансплантации циклофосфамид и бусульфан часто вызывают токсико-геморрагический цистит с патологическими изменениями уроэпителиальных клеток. Применение циклоспорина А при трансплантации костного мозга нередко сопровождается эффектами нефро- и нейротоксичности, гипертензионным синдромом, задержкой жидкости в организме и цитолизом гепатоцитов. Нарушение половой и репродуктивной функции чаще наблюдается у женщин. У детей младшего возраста после трансплантации пубертатное развитие обычно не страдает, но у детей более старшего возраста патология развития половой сферы может быть очень серьезной - вплоть до стерильности. К осложнениям, непосредственно связаным с самим трансплантатом, относятся отторжение клеток аллогенного костного мозга, несовместимость по системе АВО, острые и хронические формы реакции “трансплантат против хозяина’.

В организме пациентов после пересадки АВО-несовместимого костного мозга изоагглютинины типа “хозяин против АВО донора” вырабатываются в течение 330-605 дней после трансплантации, что может привести к продолжительному гемолизу и резко увеличить потребность в гемотрансфузиях. Указанное осложнение предотвращается переливанием эритроцитов только группы 0. После трансплантации у ряда больных отмечаются аутоиммунная нейтропения, тромбоцитопения или панцитопения, для коррекции которых необходимо производить спленэктомию.

У 35-40% реципиентов острая реакция “трансплантат против хозяина” развивается в течение 100 дней после трансплантации аллогенного НЬА-идентичного костного мозга. Степень поражения кожи, печени и кишечника варьирует от сыпи, диареи и умеренной гипербилирубинемии до десквамации кожи, кишечной непроходимости и острой печеночной недостаточности. У больных талассемией частота острой реакции “трансплантат против хозяина” I степени после трансплантации костного мозга составляет 75%, II степени и выше - 11-53%. Хроническая реакция “трансплантат против хозяина” как системный полиорганный синдром обычно развивается в течение 100-500 дней после трансплантации аллогенного костного мозга у 30-50% пациентов. Поражаются кожа, полость рта, печень, глаза, пищевод и верхние дыхательные пути. Различают ограниченную форму хронической реакции “трансплантат против хозяина”, когда поражается кожа и/или печень, и распространенную, когда генерализованное поражение кожи сочетается с хроническим агрессивным гепатитом, поражением глаз, слюнных желез или любого другого органа. Причиной смерти часто становятся инфекционные осложнения, возникающие в результате тяжелого иммунодефицита. При талассемии легкая форма хронической реакции “трансплантат против хозяина” встречается у 12%, умеренная - у 3% и тяжелая - у 0,9% реципиентов аллогенного НLА-совместимого костного мозга. Тяжелым осложнением при пересадке костного мозга является отторжение трансплантата, которое развивается через 50-130 дней после операции. Частота отторжения зависит от режима кондиционирования. В частности, у больных талассемией, получавших в период подготовки только метотрексат, отторжение трансплантата костного мозга наблюдается в 26% случаев, при комбинации метотрексата с циклоспорином А - в 9%, а при назначении только циклоспорина А - в 8% случаев (Газиев и др., 1995).

Инфекционные осложнения после трансплантации костного мозга вызывают вирусы, бактерии и грибы. Их развитие связано с глубокой нейтропенией, которую индуцируют химиопрепараты в период кондиционирования, поражением цитостатиками слизистых барьеров и реакцией “трансплантат против хозяина”. В зависимости от времени развития, различают три фазы инфекционных осложнений. В первой фазе (развивается в первый месяц после трансплантации) преобладают повреждения слизистых барьеров и нейтропения, часто сопровождающиеся вирусными инфекциями (герпес, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус, Varicella zoster), а также инфекциями, вызванными грамположи- тельными и грамотрицательными бактериями, грибами Candida, аспергиллами. В раннем посттрансплантационном периоде (второй и третий месяцы после трансплантации) самой тяжелой инфекцией является цитомегаловирусная, которая нередко приводит к смерти больных во второй фазе инфекционных осложнений. При талассемии цитомегаловирусная инфекция после трансплантации костного мозга развивается у 1,7-4,4% реципиентов. Третья фаза наблюдается в позднем посттрансплантационном периоде (через три месяца после операции) и характеризуется тяжелым комбинированным иммунодефицитом. В этом периоде обычно встречаются инфекции, вызванные Varicella zoster, стрептококком, пневмоцистой Карини, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, а также гепатотропными вирусами. При талассемии смертность больных после трансплантации костного мозга связана с бактериальным и грибковым сепсисом, идиопатической интерстициальной и цитомегаловирусной пневмониями, острым респираторным дистресс-синдромом, острой сердечной недостаточностью, тампонадой сердца, кровоизлияниями в мозг, веноокклюзионной болезнью печени и острой реакцией “трансплантат против хозяина”.

В настоящее время достигнуты определенные успехи в разработке методов выделения из костного мозга чистой популяции стволовых гемопоэтических клеток. Улучшена техника получения крови плода из пуповины и созданы методы выделения из кордовой крови кроветворных клеток. В научной печати появляются сообщения о том, что при культивировании в средах с цитокинами гемопоэтические стволовые клетки способны к размножению. При использовании для экспансии ГСК специально сконструированных биореакторов биомасса стволовых гемопоэтических клеток, выделенных из костного мозга, периферической или пуповинной крови, существенно увеличивается. Возможность экспансии ГСК является важным шагом на пути клинического развития клеточной трансплантации.

Однако перед размножением ГСК in vitro необходимо выделить гомогенную популяцию кроветворных стволовых клеток. Обычно это достигается с помощью маркеров, позволяющих избирательно пометить ГСК моноклональными антителами, ковалентно связанными с флуоресцентной или магнитной меткой, и выделить их с помощью соответствующего клеточного сортера. В то же время вопрос о фенотипических характеристиках гемопоэтических стволовых клеток окончательно не решен. А. Петренко., В. Грищенко (2003) в качестве претендентов на ГСК рассматривают клетки, на поверхности которых присутствуют CD34, АС133 и Thyl антигены и отсутствуют CD38, HLA-DR и другие маркеры дифференциации (клетки с фенотипом CD34+Liir). К маркерам линейной дифференцировки (lineage, Lin) относят гликофорин A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Перспективными для трансплантации считаются клетки с фенотипом CD34+CD45RalüW CD71low, а также CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low.

Проблемным остается вопрос о количестве ГСК, достаточном для эффективной трансплантации. В настоящее время источником стволовых кроветворных клеток являются костный мозг, периферическая и кордовая кровь, а также эмбриональная печень. Экспансия стволовых гемопоэтических клеток достигается путем их культивирования в присутствии эндотелиоцитов и гемопоэтических факторов роста. В разных протоколах для индукции пролиферации ГСК применяют миелопротеины, SCF, эритропоэтин, инсулиноподобные факторы роста, кортикостероиды и эстрогены. При использовании комбинаций цитокинов in vitro можно достичь значительного увеличения пула ГСК с пиком их выхода в конце второй недели культивирования.

Традиционно ГСК пуповинной крови применяют в основном при гемобластозах. Однако минимальная доза гемопоэтических клеток, необходимая для успешной трансплантации клеток кордовой крови, составляет 3,7 х 10⁷ ядросодержащих клеток на 1 кг массы тела реципиента. Использование меньшего количества ГСК значительно увеличивает риск несостоятельности трансплантата и рецидива заболевания. Поэтому трансплантацию кроветворных клеток пуповинной крови в основном применяют в лечении гемобластозов у детей.

К сожалению, до сих пор отсутствуют стандарты заготовки, а также стандартизированные протоколы клинического применения гемопоэтических клеток пуповинной крови. Соответственно и сами стволовые клетки кордовой крови не являются законодательно признанным источником кроветворных клеток для трансплантации. Кроме того, не существует ни этических, ни правовых норм, регламентирующих деятельность и организацию банков пуповинной кровb, которые имеются за рубежом. Между тем, для безопасной трансплантации все образцы пуповинной крови должны подвергаться тщательному контролю. До начала забора крови у беременной женщины необходимо получить на это ее согласие. Каждая беременная должна быть обследована на носительство HBsAg, наличие антител к вирусам гепатита С, ВИЧ-инфекции и сифилиса. Каждый образец кордовой крови необходимо стандартно тестировать на количество ядросодержащих клеток, СD34+ и колониеобразующую способность. Кроме того, проводится НЬА-типирование, определение группы крови по АВО и ее принадлежность по резус-фактору. Необходимыми процедурами тестирования являются бактериологический посев на стерильность, серологическое исследование на ВИЧ-1 и ВИЧ-2-инфекции, HBsAg, вирусный гепатит С, цитомегаловирусную инфекцию, НТLY-1 и НТLY-II, сифилис и токсоплазмоз. Помимо этого, для выявления цитомегаловирусной и ВИЧ-инфекции проводится полимеразная цепная реакция. Представляется целесообразным дополнить протоколы тестирования анализом ГСК пуповинной крови на выявление таких генетических заболеваний, как а-талассемия, серповидно-клеточная анемия, дефицит аденозиндезаминазы, агаммаглобулинемия Брутона, болезни Харлера и Понтера.

На следующем этапе подготовки к трансплантации встает вопрос о сохранении ГСК. Наиболее опасными для жизнеспособности клеток при их заготовке являются процедуры замораживания и размораживания. При замораживании гемопоэтических клеток значительная их часть может разрушаться из-за кристаллообразования. Для уменьшения процента гибели клеток используются специальные вещества - криопротекторы. Чаще всего в качестве криопротектора применяется ДМСО в конечной концентрации 10%. Однако для ДМСО в такой концентрации характерно прямое цитотоксическое действие, которое проявляется даже в условиях минимальной экспозиции. Снижение цитотоксического эффекта достигается жестким поддержанием нулевой температуры режима экспозиции, а также соблюдением регламента обработки материала в процессе и после размораживания (скорость проведения всех манипуляций, применения процедур многоразового отмывания). Не следует применять концентрацию ДМСО менее 5%, так как при этом в период замораживания происходит массовая гибель кроветворных клеток.

Наличие примесей эритроцитов в суспензионной смеси ГСК создает опасность развития реакции несовместимости по эритроцитарным антигенам. В то же время при удалении эритроцитов значительно возрастают потери гемопоэтических клеток. В связи с этим предложена методика нефракционированного выделения ГСК. В данном случае для защиты ядросодержащих клеток от повреждающего воздействия низких температур используют 10% раствор ДМСО и охлаждение с постоянной скоростью (ГС/мин) до -80°С, после чего клеточную взвесь замораживают в жидком азоте. Считается, что при такой методике криоконсервации происходит частичный лизис эритроцитов, поэтому образцы крови не требуют фракционирования. Перед трансплантацией клеточную взвесь размораживают, отмывают от свободного гемоглобина и ДМСО в растворе человеческого альбумина или в сыворотке крови. Сохранность гемопоэтических предшественников при использовании данного метода действительно выше, чем после фракционирования пуповинной крови, однако опасность трансфузионных осложнений вследствие переливания АВО-несовместимых эритроцитов сохраняется.

Учреждение системы банков для хранения тестированных и типированных по HLA образцов ГСК могло бы решить приведенные выше проблемы. Однако для этого нужно разработать этические и юридические нормы, которые в настоящее время пока еще только обсуждаются. Перед созданием банковской сети необходимо принять целый ряд положений и документов по стандартизации процедур забора, фракционирования, тестирования и типирования, а также криоконсервации ГСК. Обязательным условием эффективной деятельности банков ГСК является организация компьютерной базы для взаимосвязи с регистрами Мировой донорской костномозговой ассоциации (WMDA) и Национальной донорской костномозговой программы Соединенных Штатов (NMDP).

Кроме того, следует оптимизировать и стандартизировать методики экспансии ГСК in vitro, в первую очередь гемопоэтических клеток кордовой крови. Размножение ГСК пуповинной крови необходимо для увеличения числа потенциальных реципиентов, совместимых по HLA-системе. Из-за небольших объемов кордовой крови количество содержащихся в ней ГСК, как правило, не в состоянии обеспечить репопуляцию костного мозга у взрослых больных. В то же время для проведения неродственных трансплантаций необходимо иметь доступ к достаточному количеству типированных образцов ГСК (от 10 000 до 1 500 000 на 1 реципиента).

Трансплантация стволовых кроветворных клеток не устраняет осложнений, сопровождающих пересадку костного мозга. Анализ показывает, что при трансплантации стволовых клеток пуповинной крови тяжелые формы острой реакции “трансплантат против хозяина” развиваются у 23%, хронической - у 25% реципиентов. У онкогематологических больных рецидивы острого лейкоза в течение первого года после трансплантации ГСК кордовой крови наблюдаются в 26% случаев.

В последние годы интенсивно развиваются методы трансплантации периферических гемопоэтических стволовых клеток. Содержание ГСК в периферической крови настолько мало (на 100 000 клеток крови приходится 1 ГСК), что их выделение без специальной подготовки не имеет смысла. Поэтому донору предварительно проводят курс медикаментозной стимуляции выброса гемопоэтических клеток костного мозга в кровь. С этой целью используются такие далеко не безвредные препараты, как циклофосфамид и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Но даже после процедуры мобилизации ГСК в периферическую кровь содержание в ней СD34+-клеток не превышает 1,6%.

Для мобилизации ГСК в клинике чаще используют С-СЭК, который характеризуется относительно хорошей переносимостью, за исключением почти закономерного появления болей в костях. Надо заметить, что применение современных сепараторов крови позволяет достаточно эффективно выделять стволовые предшественники кроветворения. Однако в условиях нормального гемопоэза для получения достаточного количества гемопоэтических стволовых клеток, сопоставимого по репопулятивной способности сіл костномозговой взвеси, необходимо выполнить как минимум 6 процедур. При каждой такой процедуре на сепараторе обрабатывается 10-12 л крови, что может вызвать тромбоцитопению и лейкопению. Процедура сепарации предусматривает введение донору антикоагулянта (натрия цитрат), что не исключает, однако, контактной активации тромбоцитов в процессе экстракорпорального центрифугирования. Эти факторы создают условия для развития инфекционных и геморрагических осложнений. Еще один недостаток метода заключается в значительной вариабельности мобилизационного ответа, что требует мониторинга содержания ГСК в периферической крови доноров, необходимого для определения их максимального уровня.

Аутогенная трансплантация ГСК, в отличие от аллогенной, полностью исключает развитие реакции отторжения. Тем не менее, существенным недостатком аутотрансплантации стволовых гемопоэтических клеток, ограничивающим спектр показаний к ее проведению, является высокая вероятность реинфузии клеток лейкозного клона с трансплантатом. Кроме того, отсутствие иммуноопосредованного эффекта “трансплантат против опухоли” значительно повышает частоту рецидивов злокачественного заболевания крови. Поэтому единственным радикальным способом элиминации неопластического клонального гемопоэза и восстановления нормального поликлонального кроветворения при миелодиспластических синдромах остается интенсивная полихимиотерапия с трансплантацией аллогенных ГСК.

Но даже в этом случае лечение при большинстве гемобластозов направлено лишь на увеличение сроков выживаемости больных и улучшение качества их жизни. По данным нескольких крупных исследований, длительная безрецидивная выживаемость после аллотрансплантации ГСК достигается у 40% онкогематологических больных. При использовании стволовых клеток НЬА-совместимого сиблинга лучшие результаты наблюдаются у молодых больных с коротким анамнезом заболевания, количеством бластных клеток до 10% и благоприятной цитогенетикой. К сожалению, смертность, связанная с процедурой аллотрансплантации ГСК, у пациентов с миелодиспластическими заболеваниями остается высокой (в большинстве сообщений - около 40%). Результаты 10-летней работы Национальной программы донорства костного мозга США (510 больных, медиана возраста - 38 лет) свидетельствуют, что безрецидивная выживаемость в течение двух лет составляет 29% при относительно низкой вероятности рецидива (14%). Однако смертность, обусловленная процедурой аллотрансплантации ГСК от неродственного донора, чрезвычайно высока и достигает за двухлетний период 54%. Подобные результаты получены и в Европейском исследовании (118 больных, медиана возраста - 24 года, двухлетняя безрецидивная выживаемость - 28%, рецидив - 35%, смертность - 58%).

При проведении интенсивных курсов химиотерапии с последующим восстановлением кроветворения аллогенными гемопо- этическими клетками часто возникают иммуногематологические и трансфузионные осложнения. Во многом они связаны с тем, что группы крови у человека наследуются независимо от молекул МНС. Поэтому, даже если донор и реципиент совместимы по основным НLА-антигенам, их эритроциты могут иметь различный фенотип. Выделяют “большую” несовместимость, когда у реципиента предсуществуют антитела к антигенам эритроцитов донора, и “малую”, когда у донора имеются антитела к антигенам эритроцитов реципиента. Возможны случаи сочетания “большой” и “малой” несовместимости.

Результаты сравнительного анализа клинической эффективности аллотрансплантаций костного мозга и стволовых гемопоэтических клеток пуповинной крови при гемобластозах свидетельствуют о том, что у детей после аллотрансплантации ГСК кордовой крови значительно снижается риск развития реакции “трансплантат против хозяина”, однако наблюдается более продолжительный срок восстановления числа нейтрофилов и тромбоцитов при более высокой частоте 100-дневной посттрансплантационной смертности.

Изучение причин ранней летальности позволило уточнить противопоказания к аллогенной трансплантации ГСК, среди которых важнейшими являются:

• наличие у реципиента или донора положительных тестов на цитомегаловирусную инфекцию (без проведения превентивного лечения);
• острая лучевая болезнь;
• наличие или даже подозрение на наличие у пациента микозной инфекции (без проведения системной ранней профилактики фунгицидными препаратами);
• гемобластозы, при которых больные получали длительное лечение цитостатиками (из-за высокой вероятности внезапной остановки сердца и полиорганной недостаточности);
• пересадка от HLA-неидентичных доноров (без профилактики острой реакции “трансплантат против хозяина” циклоспорином А);
• хронический вирусный гепатит С (в связи с высоким риском развития веноокклюзионной болезни печени).

Таким образом, трансплантация ГСК способна вызвать серьезные осложнения, которые нередко приводят к летальному исходу. В раннем (до 100 дней после трансплантации) периоде к таковым относятся инфекционные осложнения, острая реакция “трансплантат против хозяина”, реакция отторжения трансплантата (неприживление ГСК донора), веноокклюзионная болезнь печени, а также обусловленные токсичностью режима кондиционирования поражения тканей, для которых характерна высокая скорость ремоделирования (кожа, сосудистый эндотелий, эпителий кишечника). К осложнениям позднего посттрансплантационного периода относятся хроническая реакция “трансплантат против хозяина”, рецидивы основного заболевания, задержка роста у детей, нарушение функции репродуктивной системы и щитовидной железы, поражение глаз.

В последнее время, в связи с появлением публикаций о пластичности клеток костного мозга, возникла идея использования ГСК для лечения инфарктов и других болезней. Хотя некоторые опыты на животных и свидетельствуют в пользу такой возможности, однако выводы о пластичности клеток костного мозга нуждаются в подтверждении. Это обстоятельство должно приниматься во внимание теми исследователями, которые считают, что трансплантированные клетки костного мозга человека легко трансформируются в клетки скелетных мышц, миокарда или ЦНС. Гипотеза о том, что ГСК являются естественным клеточным источником регенерации этих органов, нуждается в серьезных доказательствах.

В частности, опубликованы первые результаты открытого рандомизированного исследования В. Беленкова (2003), цель которого - изучение влияния С-СвК (то есть, мобилизации в кровь аутологичных ГСК) на клинический, гемодинамический и нейрогуморальный статус больных с умеренной и тяжелой хронической сердечной недостаточностью, а также оценка его безопасности на фоне стандартной терапии (ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, бета-адреноблокаторы, диуретики, сердечные гликозиды). В первой публикации результатов исследования авторы программы отмечают, что единственным доводом в пользу О-СвР являются результаты лечения одного больного, у которого на фоне терапии этим препаратом установлено бесспорное улучшение всех клинических и гемодинамических показателей. Однако теория мобилизации ГСК в кровоток с последующей регенерацией миокарда в постинфарктной зоне не подтвердилась - даже у больного с позитивной клинической динамикой стресс-эхокардиография с добутамином не выявила появления зон жизнеспособного миокарда в рубцовой области.

Нельзя не отметить тот факт, что к настоящему моменту данных, позволяющих рекомендовать заместительную клеточную терапию для широкого внедрения в повседневную клиническую практику, явно недостаточно. Необходимы хорошо продуманные и качественно выполненные клинические исследования, направленные на определение эффективности различных вариантов регенеративной клеточной терапии, разработку показаний и противопоказаний к ней, а также методических рекомендаций по комбинированному применению регенеративно-пластической терапии и традиционного хирургического или консервативного лечения. До сих пор не получен ответ на вопрос о том, какая именно популяция клеток костного мозга (стволовые гемопоэтические или стромальные) может давать начало нейронам и кардиомиоцитам, а также не ясно, какие именно условия способствуют этому in vivo.

Работа в этих направлениях проводится во многих странах. В резюме симпозиума по острой печеночной недостаточности Национального института здоровья США среди перспективных методов лечения, наряду с трансплантацией печени, отмечены пересадка ксено- или аллогенных гепатоцитов и экстракорпоральное подключение биореакторов с клетками печени. Имеются прямые свидетельства того, что только чужеродные функционально активные гепатоциты способны обеспечить эффективную поддержку печени реципиента. Для клинического применения изолированных гепатоцитов необходимо создание банка клеток, что позволит значительно сократить время между выделением клеток и их использованием. Наиболее приемлемой для создания банка изолированных гепатоцитов является криоконсервация клеток печени в жидком азоте. При использовании таких клеток в клинике у больных с острой и хронической печеночной недостаточностью выявлен достаточно высокий лечебный эффект.

Несмотря на оптимистические и обнадеживающие результаты применения трансплантации клеток печени в эксперименте и клинике, остается немало проблем, еще далеких от своего решения. К таковым относятся ограниченное количество пригодных органов для получения изолированных гепатоцитов, недостаточно эффективные методы их выделения, отсутствие стандартизированных способов консервации клеток печени, нечеткие представления о механизмах регуляции роста и пролиферации пересаженных клеток, отсутствие адекватных методов оценки приживления или отторжения аллогенных гепатоцитов. Сюда же следует отнести наличие трансплантационного иммунитета при использовании алло- и ксеногенных клеток, хотя и меньшего, чем при ортотопической трансплантации печени, но требующего применения иммуносупрессоров, инкапсулирования изолированных гепатоцитов или их специальной обработки ферментами. Трансплантация гепатоцитов нередко приводит к иммунному конфликту между реципиентом и донором в виде реакции отторжения, что требует применения цитостатиков. Одним из решений этой проблемы может стать использование полимерных микропористых носителей для изоляции клеток печени, что улучшит их выживание, поскольку мембрана капсулы эффективно защищает гепатоциты, несмотря на иммунизацию хозяина.

Однако при острой печеночной недостаточности такая пересадка гепатоцитов не дает эффекта из-за достаточно продолжительного времени, необходимого для приживления клеток печени в новой среде с выходом на этап оптимального функционирования. Потенциальным ограничением является секреция желчи при эктопической трансплантации изолированных гепатоцитов, а при использовании биореакторов существенным физиологическим барьером выступает видовое несоответствие между белками человека и белками, которые продуцируют ксеногенные гепатоциты.

В литературе имеются сообщения о том, что локальная трансплантация стромальных стволовых клеток костного мозга способствует эффективной коррекции костных дефектов, причем восстановление костной ткани в этом случае протекает более интенсивно, чем при спонтанной репаративной регенерации. В нескольких доклинических исследованиях на экспериментальных моделях убедительно показана возможность применения трансплантатов стромальных клеток костного мозга в ортопедии, хотя для оптимизации этих методик, даже в простейших случаях, необходима дальнейшая работа. В частности, оптимальные условия экспансии остеогенных стромальных клеток ex vivo еще не найдены, не отработанными остаются структура и состав их идеального носителя (матрицы). Не определено минимальное количество клеток, необходимое для объемной регенерации кости.

Доказано, что мезенхимальные стволовые клетки проявляют трансгермальную пластичность - способность дифференцироваться в клеточные типы, фенотипически не связанные с клетками первоначальной линии. При оптимальных условиях культивирования поликлональные линии стволовых клеток стромы костного мозга выдерживают in vitro более 50 делений, что дает возможность получить миллиарды стромальных клеток из 1 мл костномозгового аспирата. Однако популяция мезенхимальных стволовых клеток отличается гетерогенностью, что проявляется как вариабельностью размеров колоний, разной скоростью их образования, так и морфологическим разнообразием клеточных типов - от фибробластоподобных веретенообразных до крупных плоских клеток. Уже через 3 недели культивирования стромальных стволовых клеток наблюдается фенотипическая гетерогенность: одни колонии образуют узелки костной ткани, другие - скопления адипоцитов, иные, более редкие, формируют островки хрящевой ткани.

Для лечения дегенеративных заболеваний ЦНС поначалу использовалась трансплантация эмбриональной нервной ткани. В последние годы вместо ткани эмбрионального мозга стали трансплантировать клеточные элементы нейросфер, полученных из нейральных стволовых клеток (.Полтавцева, 2001). Нейросферы содержат коммитированные предшественники нейронов и нейроглии - это дает надежду на восстановление утраченных функций мозга после их трансплантации. После пересадки клеток диспергированных нейросфер в область полосатого тела мозга крысы отмечены их пролиферация и дифференцировка в дофаминергические нейроны, что устраняло двигательную асимметрию у крыс с экспериментальным гемипаркинсонизмом. Однако в некоторых случаях из клеток нейросфер развивались опухоли, что приводило к гибели животных (Bjorklund, 2002).

В клинике тщательные исследования двух групп больных, в которых ни больные, ни наблюдавшие за ними врачи не знали (двойное слепое исследование), что одной группе пациентов трансплантировали эмбриональную ткань с нейронами, продуцирующими дофамин, а второй группе больных делали ложную операцию, дали неожиданные результаты. Пациенты, которым пересаживали эмбриональную нервную ткань, чувствовали себя не лучше, чем больные контрольной группы. Кроме того, у 5 из 33 пациентов через 2 года после трансплантации эмбриональной нервной ткани развилась персистентная дискинезия, которой не было у больных группы контроля (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Одной из нерешенных задач клинического исследования нейральных стволовых клеток мозга остается анализ реальных перспектив и ограничений трансплантации их производных для коррекции нарушений ЦНС. Не исключено, что индуцируемый длительной судорожной активностью нейроногенез в гиппокампе, приводящий к его структурным и функциональным перестройкам, может быть фактором прогрессирующего развития эпилепсии. Такой вывод заслуживает особого внимания, поскольку указывает на возможные негативные последствия генерации новых нейронов в зрелом мозге и формирования ими абберантных синаптических связей.

Не следует забывать, что культивирование в средах с цитокинами (митогенами) приближает характеристики стволовых клеток к таковым у клеток опухолей, поскольку в них происходят близкие изменения регуляции клеточных циклов, определяющие способность к неограниченному делению. Безрассудно трансплантировать человеку ранние производные эмбриональных стволовых клеток, так как в этом случае угроза развития злокачественных новообразований очень велика. Значительно безопаснее использовать их более коммитированное потомство, то есть, клетки-предшественники дифференцированных линий. Однако в настоящее время еще не отработана надежная техника получения стабильных линий клеток человека, дифференцирующихся в нужном направлении.

Применение технологий молекулярной биологии для коррекции наследственной патологии и заболеваний человека с помощью модификации стволовых клеток представляет большой интерес для практической медицины. Особенности генома стволовых клеток дают возможность разработки уникальных схем трансплантации с целью коррекции генетических заболеваний. Но и в этом направлении имеется ряд ограничений, которые нужно преодолеть до начала практического применения генной инженерии стволовых клеток. Прежде всего необходимо оптимизировать процесс модификации генома стволовых клеток ex vivo. Известно, что длительная (3-4 недели) пролиферация стволовых клеток снижает их трансфицируемость, поэтому для достижения высокого уровня их генетической модификации необходимо проведение нескольких циклов трансфицирования. Однако основная проблема связана с длительностью экспрессии терапевтического гена. До сих пор ни в одном из исследований период эффективной экспрессии после трансплантации модифицированных клеток не превышал четырех месяцев. В 100% случаев с течением времени экспрессия трансфицированных генов снижается по причине инактивации промоторов и/или гибели клеток с модифицированным геномом.

Немаловажной проблемой является стоимость применения клеточных технологий в медицине. Например, ориентировочная ежегодная потребность в финансировании только медицинских расходов отделения пересадки костного мозга, рассчитанного на выполнение 50 трансплантаций в год, составляет около 900 000 долларов США.

Развитие клеточных технологий в клинической медицине - сложный и многоэтапный процесс, предполагающий конструктивное сотрудничество многопрофильных научных и клинических центров и международного сообщества. При этом особого внимания требуют вопросы научной организации исследований в области клеточной терапии. Наиболее важными из них являются разработка протоколов клинических исследований, контроль достоверности клинических данных, формирование национального регистра исследований, интеграция в международные программы многоцентровых клинических исследований и внедрение результатов в клиническую практику.

Завершая введение в проблемы клеточной трансплантологии, хотелось бы выразить надежду на то, что объединение усилий ведущих специалистов Украины из разных областей науки обеспечит существенный прогресс в экспериментальных и клинических исследованиях и позволит в ближайшие годы найти эффективные пути оказания помощи тяжело больным людям, нуждающимся в трансплантации органов, тканей и клеток.

[13], [14], [15], [16], [17], [18]