Иммунологические исследования в урологии

Назначение иммунограммы урологическому больному означает, что лечащий врач предполагает наличие нарушений в иммунной системе. Повторяющиеся бактериальные, вирусные, грибковые инфекции, аллергические проявления, системные заболевания могут быть признаками этих нарушений, для которых характерен ряд синдромов (инфекционный, онкологический, аллергический, аутоиммунный, лимфопролиферативный). У одного больного может быть несколько синдромов. Например, хронические инфекционные заболевания (инфекционный синдром) могут вызвать иммунодефицит, а иммунодефицит может проявляться предрасположенностью к инфекционным и онкологическим заболеваниям (онкологический синдром). Предрасположенность к инфекциям может возникать на фоне вторичного иммунодефицита, развившегося вследствие лимфопролиферативного заболевания, например лейкоза. Различают три основные группы патологических изменений иммунной системы:

• количественная или функциональная недостаточность того или иного звена иммунитета, что ведёт к развитию иммунодефицитного состояния;
• нарушение в распознавании антигена иммунной системой, приводящее к развитию аутоиммунных процессов;
• гиперреактивный или «извращённый» иммунный ответ, проявляющийся развитием аллергических заболеваний.

Различают скрининговые (тесты 1 уровня) и уточняющие (тесты 2 уровня) методы иммунодиагностики. Первые существуют для фиксирования нарушений в иммунной системе, вторые - для установления механизмов, задействованных в их реализации с целью дальнейшей иммунокоррекции.

В-Клеточное звено иммунитета

Скрининговые методы

• Определение относительного и абсолютного количества В-лимфоцитов с помощью реакции иммунофлюоресценции или проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител к В-клеточным антигенам (CD19, CD20, где CD - кластеры дифференцировки). Содержание В-лимфоцитов в норме у взрослых: 8-19% от общего количества лейкоцитов или 190-380 клеток/мкл. Повышение содержания В-лимфоцитов возникает при острых и хронических бактериальных и грибковых инфекциях, хронических заболеваниях печени, системных заболеваниях соединительной ткани, хроническом лимфолейкозе, миеломной болезни.
• Определение концентрации неспеспецифических иммуноглобулинов (F, М, G, Е) методом простой радиальной иммунодиффузии, нефелометрии или турбометрии, радиоиммунным анализом или иммуноферментным анализом (ИФА). Нормы для взрослых: иммуноглобулин (Ig) A 0.9-4.5 г/л. IgM 03-3.7 г/л. IgG 8.0-17 г/л. Увеличение концентрации иммуноглобулинов возникает при тех же патологических состояниях, при которых происходит увеличение содержания В-лимфоцитов. Снижение концентрации иммуноглобулинов бывает при врождённой гипогаммаглобулинемии, новообразованиях иммунной системы, удалении селезёнки, потере белка, при заболеваниях почек или кишечника, лечении цитостатиками и иммунодепреесантами.

Уточняющие методы

• Определение в крови циркулирующих иммунных комплексов методом селективной преципитации в полизтиленгликоле с последующим спектрофотометрическим исследованием плотности (норма 80-20 УЕ). Повышение циркулирующих иммунных комплексов характерно для острых бактериальных, грибковых, вирусных инфекций, аутоиммунных, иммунокомплексных заболеваний, сывороточной болезни, аллергических реакций 3 типа;
• Определение в крови специфических иммуноглобулинов по отношению к бактериальным и вирусным антигенам, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) при аутоиммунных заболеваниях, выявление антиспермальных (аутоиммунное бесплодие) и противопочечных антител (пиелонефрит и гломерулонефрит) методом радиальной иммунодиффузии или ИФА.
• Определение в сперме антиспермальных антител [MAR-тест (mixed antiglobulin reaction - смешанная антиглобулиновая реакция)], норма - отрицательный результат.
• Определение в моче концентрации иммуноглобулинов с целью дифференциальной диагностики между пиелонефритом и гломерулонефритом (селективность протеинурии).
• Определение содержания IgE в соке простаты с целью диагностики аллергического простатита методом радиальной иммунодиффузии или ИФА. 
• Исследование ответа в реакции бласттрансформации В-лимфоцитов на В-клеточный митоген (митоген лаконоса для стимуляции реакции бласттрансформации В-лимфоцитов в присутствии Т-лимфоцитов), нормативное значение которой 95-100%.

Т-клеточное звено иммунитета

Скрининговые методы

• Определение относительного и абсолютного числа зрелых CD3 Т-лимфоцитов методом реакции иммунофлюоресценции или проточной цитофлюорометрии с использованием моноклональных анти-СDЗ-антител. Норма для взрослых 58-76% или 1100-1700 клеток/мкл. Снижение числа Т-лимфоцитов показатель недостаточности клеточного звена иммунитета. Это характерно для некоторых вторичных и первичных иммунодефицитов (хронические бактериальные и вирусные инфекции: туберкулез, синдром приобретённого иммунодефицита, злокачественные опухоли, хроническая почечная недостаточность, травмы, стресс, старение, недостаточность питания, лечение цитостатиками, действие ионизирующего излучения). Повышение числа Т-лимфоцитов бывает на фоне гиперактивности иммунитета или при лимфопролиферативных заболеваниях. При воспалении количество Т-лимфоцитов сначала повышается, а затем снижается. Отсутствие снижения Т-лимфоцитов говорит о хронизации воспалительного процесса.
• Оценка субпопопуляций лимфоцитов.
  • Определение количества Т-хелперов (анти-СD4-антитела). В норме 36-55% или 400-1100 клеток/мкл. Увеличение числа этих клеток возникает при аутоиммунных заболеваниях, болезни Вальденстрема, активации антитрансплантационного иммунитета; снижение числа Т-хелперов происходит при хронических бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, туберкулёзе, синдроме приобретённого иммунодефицита, злокачественных опухолях, ожогах, травмах, недостаточности питания, старении, лечении цитостатиками, действии ионизирующего излучения.
  • Определение количества Т-супрессоров (анти-СD4-антитела). В норме 17-37% или 300-700 клеток/мкл. Увеличение числа Т-супрессоров возникает при тех же состояниях, при которых снижается количество Т-хелперов, а их понижение при тех же состояниях, при которых содержание Т-хелперов повышается.
  • Иммунорегуляторный индекс CD4/CD8, в норме 1,5-2,5. Гиперактивность при показателях более 2,5 (аллергические и аутоиммунные заболевания); гипоактивность - менее 1,0 (предрасположенность к хроническим инфекциям). В начале воспалительного процесса иммунорегуляторный индекс повышается, при стихании - нормализуется.

Уточняющие методы

• Определение количества естественных киллеров (NK-клетки) - анти-CD16- и анти-СD56-антител. Норма для CD 16-лимфоцитов составляет 6-26%, CD56 - 9-19%. Повышение числа NK-клеток происходит при отторжении трансплантата, снижение - при вирусных инфекциях, онкологических заболеваниях, первичных и вторичных иммунодефицитах, ожогах, травмах и стрессе, лечении цитостатиками и воздействии ионизирующего излучения. 
• Определение количестваТ-лимфоцитов с рецептором к интерлейкину-2 (активационный маркёр) - анти-СD25-антител. Норма 10-15%. Увеличение их числа наблюдают при аллергических заболеваниях, отторжении трансплантата, ответе на тимусзависимые антигены в острый период первичной инфекции, уменьшение - при тех же заболеваниях, при которых происходит уменьшение количества NK-клеток.
• Исследование экспрессии активационного маркёра - молекулы гистосовместимости II класса HLA-DR. Повышение экспрессии возникает при воспалительных процессах, у больных с гепатитом С, целиакией, сифилисом, острыми респираторными заболеваниями.
• Оценка апоптоза лимфоцитов. Ориентировочное представление о готовности лимфоцитов к апоптозу можно определить по экспрессии на их поверхности Fas-рецептора (CD95) и в митохондриях протоонкогена bd-2. Апоптоз лимфоцитов оценивают путём их обработки двумя флюоресцентными красителями: пропидиумом йодидом, который связывается с фрагментами ДНК, и аннексином Y, связывающимся с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток в начале апоптоза. Оценку результатов проводят на проточном цитофлюориметре. Учёт результатов основан на соотношении клеток, окрашенных различными красителями. Неокрашенные клетки жизнеспособны, клетки, связанные только с аннексином Y, - ранние проявления апоптоза, с пропидия йодидом и аннексином У - поздние проявления апоптоза, окрашивание только пропидия йодидом свидетельствует о некрозе.
• Оценка пролиферации Т-лимфоцитов in vitro.
  • Изменение бластогенеза клеток - реакция бласттрансформации лимфоцитов. Лейкоциты инкубируют с любым митогеном растительного происхождения (лектины). Чаще используют фитогемагглютинин в течение 72 ч, затем делают мазок, окрашивают его и подсчитывают количество бластов! Индекс стимуляции - отношение процента трансформированных клеток в опыте (культура с фитогемагглютинином) к проценту трансформированных клеток в контроле (культура без фитогемагглютинина). Реакцию бласттрансформации лимфоцитов можно оценивать по включению в культивируемые клетки радиоактивной метки (ЗН-тимндин), так как при делении клеток увеличивается синтез ДНК. Нарушения в пролиферативном ответе возникают как при первичных, так и при вторичных иммунодефицитах, ассоциированных с инфекциями, онкологическими заболеваниями, почечной недостаточностью, оперативными вмешательствами.
  • Оценка в этих исследованиях экспрессии активационных маркёров (CD25, рецептор к трансферрину - CD71) и молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR, которые практически отсутствуют на покоящихся Т-лимфоцитах. Т-лимфоциты стимулируют фитогемагглютинином, через 3 сут анализируют экспрессию активационных маркёров методом прямой или непрямой реакции иммунофлюоресценции, проточной цитофлюориметрии, используя моноклональные антитела к выделяемым рецепторам.
  • Измерение количества медиаторов, синтезируемых активированными Т-лимфоцитами [интерлейкин (ИЛ) 2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, у-интерферона и др.], с помощью радиоиммунного анализа или ИФА. Особенно важна оценка концентрации у-интерферона и ИЛ-4 как маркёров ТЫ и Th2 в супернатанте активированных культур и внутри клетки. При возможности полезно определять экспрессию гена для соответствующего цитокина по уровню матричной рибонуклеиновой кислоты в клетке-продуценте и интенсивности экспрессии рецепторов для соответствующих цитокинов.
    
• Реакция торможения миграции лимфоцитов. Сенсибилизированные Т-лимфоциты в реакции с антигеном выделяют лимфокины, в том числе факторы. ингибирующие миграцию лимфоцитов. Феномен торможения наблюдают при внесении в культуру клеток митогенов. Оценка степени торможения позволяет судить о способности лимфоцитов выделять цитокины. В норме частота миграции в зависимости от специфического митогена составляет 20-80%.
• Оценка цитотоксичности NK-клеток. Определяют способность естественных киллерных клеток убивать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562. Если оценивают антителозависимую цитотоксичность, используют клетки-мишени, покрытые антителами класса IgG. Клетки-мишени метят ЗН-уридином и инкубируют с клетками-эффекторами. Гибель клеток-мишеней оценивают по выходу радиоактивной метки в раствор. Снижение цитотоксичности происходит при злокачественных новообразованиях. В некоторых случаях, когда необходим прогноз эффективности лечения интерлейкинами, оценивают цитотоксичность NK-клеток при инкубации с определёнными цитокинами.

Исследование функции фагоцитов

Скрининговые методы

Исследование интенсивности поглощения микробных клеток фагоцитами (фагоцитоз частиц латекса, тест-культуры стафилококка, кишечной палочки или микроорганизмов, выделенных у больного). Путём центрифугирования гепаринизированной крови выделяют взвесь лейкоцитов, добавляют сыворотку IV группы крови для опсонизации (опсонины - белки, усиливающие фагоцитоз). Микробную взвесь разбавляют, смешивают с лейкоцитами и инкубируют в течение 120 мин, отбирая пробы для анализа через 30.90.120 мин после начала инкубации. Из отобранной лейкоцитарной взвеси делают мазки. Определяют следующие показатели фагоцитоза:

• фагоцитарный индекс - процент клеток, вступивших в фагоцитоз за 30 мин и 120 мин инкубации; нормативное значение фагоцитарного индекса (30) 94% фагоцитарного индекса (120) - 92%;
• фагоцитарное число - среднее число бактерий, находящихся внутриклеточно; нормативное значение фагоцитарного числа (30) 11%, Фагоцитарного числа (120) - 9,8%;  
• коэффициент фагоцитарного числа - отношение фагоцитарного числа (30) к фагоцитарному числу (120); в норме 1,16;
• индекс бактерицидности нейтрофилов - отношение числа убитых внутри фагоцитов микробов к общему числу поглощённых микробов; в норме 66%.

Уточняющие методы

• Исследование бактерицидности фагоцитов в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ) - НСТ-тест. К лейкоцитам добавляют краситель нитросиний тетразолий жёлтого цвета. При поглощении нейтрофилом красителя под действием свободных радикалов кислорода идёт процесс восстановления, в результате этого возникает синее окрашивание. Реакцию проводят в 96-луночном плоскодонном планшете. В первые три лунки со смесью НСТ и лейкоцитов добавляют раствор Хенкса (спонтанный НСТ), во вторые - частицы латекса; инкубируют при 37 С 25 мин. Результаты считывают при 540 нм на ридере и выражают в условных единицах. Рассчитывают коэффициент стимуляции (К_ст), равный отношению оптической плотности в стимулированных лунках к средней оптической плотности в лунках без стимуляции. У здоровых людей НСТ_спонт=90±45 УЕ, НСТ_стим=140±60 УЕ. К_ст=1,78±0.36.
• Исследование молекул адгезии. С помощью проточной цитофлюориметрии определяют экспрессию поверхностных антигенов CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Иммунодефициты с нарушением адгезии проявляются рецидивирующими инфекциями, медленным заживлением ран и отсутствием гноя в очагах инфекции.

Исследование системы комплемента

Скрининговые методы

Определение гемолитической активности комплемента - исследование классического пути активации комплемента. Разные разведения сыворотки больного и здорового человека добавляют к эритроцитам барана, покрытым антителами. За единицу гемолитической активности принимают величину, обратную тому разведению сыворотки, при которой разрушается 50% эритроцитов. Степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. Снижение гемолитической активности комплемента наблюдают при системной красной волчанке с поражением почек, остром гломерулонефрите. комбинированных иммунодефицитах, миастении, вирусном гепатите, лимфомах, увеличение - при обструктивной желтухе, тиреоидите Хасимото. ревматизме, ревматоидном артрите, узелковом периартериите. дерматомиозите, инфаркте миокарда, язвенном колите, синдроме Рейтера, подагре.

Уточняющие методы

• Определение компонентов комплемента. Количественное определение проводят методом радиальной иммунодиффузии и нефелометрии.
  Исследование неинформативно, если не изменены антигенные свойства компонентов комплемента.
• Установлено, что Clq-компонент комплемента усиливает фагоцитоз и опосредует клеточную цитотоксичность. Его снижение происходит при болезнях иммунных комплексов, системной красной волчанке, гнойных инфекциях и опухолях.
• С3-компонент участвует в активации классического и альтернативного пути комплемента. Снижение его концентрации связывают с хроническими бактериальными и грибковыми инфекциями, наличием циркулирующих или тканевых иммунных комплексов.
• С4-компонент участвует в активации классического пути. Снижение его концентрации связывают с продолжительной активацией комплемента иммунными комплексами и снижением концентрации С1-ингибитора, контролирующего активацию классического пути комплемента. Дефицит С4 бывает при системной красной волчанке, увеличение С4 происходит при болезнях почек, отторжении трансплантата, остром воспалении, заболеваниях желудочно-кишечного тракта.
• С5а-малый фрагмент молекулы С5, отщепляющийся от неё в результате активации системы комплемента. Повышение его концентрации возникает при воспалении, сепсисе, атопических и аллергических заболеваниях.
• Cl-ингибитор - многофункциональный фактор. Он контролирует активацию С1-компонента комплемента, подавляет активность калликреина, плазмина и активированного фактора Хагемана, протеаз Cls и Or. Дефицит С1-ингибитора приводит к ангионевротическому отёку.
• ункциональные исследования комплемента. К стандартной сыворотке, лишённой какого-либо компонента комплемента, добавляют исследуемую сыворотку и определяют гемолитическую активность комплемента. Если гемолитическая активность не восстанавливается до нормы, считают, что активность этого компонента комплемента в исследуемой сыворотке снижена.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]